![]()
A single NLR gene confers resistance to leaf and stripe rust in wheat | Nature Communications，2024年11月15日在线发表于nature communications期刊。
小麦叶锈病（由Puccinia triticina Eriks., Pt引起）和条锈病（由P. striiformis Westend. f. sp. tritici Eriks., Pst引起）是常见且具有重要经济意义的病害，在未采取防治措施时，这些病害可造成整片田地的毁灭性损失。除了使用化学杀菌剂外，抗病基因（R基因）是保护小麦免受锈病病原侵害的主要手段。近年来，随着高侵染力病原菌小种的出现、病原菌小种毒力的变化以及全球变暖导致的病原菌分布变化，锈病发生率和相关年损失呈现显著上升趋势。这些因素突出了发现新的抗锈病资源以保护小麦生产力的重要性。目前，小麦已知的抗锈病R基因超过200个，这些基因大多来源于小麦的一级基因库，如粗山羊草（Aegilops tauschii）以及易于与现代小麦杂交的四倍体和二倍体小麦种。然而，来自二级基因库的植物（如山羊草属的Sitopsis组）尚未被广泛开发。近年来，基因分离方法的进步显著增加了抗病基因的克隆数量。迄今为止，已克隆32个抗锈病基因，其中超过一半是在过去五年内完成的，许多基因来源于小麦二级基因库。已克隆的大多数禾本科抗病基因属于核苷酸结合-亮氨酸富集重复（NLR）类型，这些基因编码独特的胞内受体，能够识别特定病原效应蛋白。然而，核苷酸结合-亮氨酸富集重复（NLR）抗病基因通常仅赋予对单一病原菌小种的抗性。沙融山羊草（Aegilops sharonensis）和高大山羊草（Aegilops longissima）是小麦二级基因库中密切相关的二倍体物种，富含具有农业重要性的性状。本文报道了Yr87/Lr85，一个来源于沙融山羊草（Aegilops sharonensis）和高大山羊草（Aegilops longissima）的NLR基因，能够同时赋予对引起条锈病的小麦条锈菌（P. striiformis tritici, Pst）和引起叶锈病的小麦叶锈菌（Puccinia triticina, Pt）的抗性，扩展了作者对其遗传防御机制的认识。Yr87/Lr85在小麦渐渗系和转基因系中均表现出对Pst和Pt的抗性。通过比较Yr87/Lr85与已克隆的小麦族（Triticeae）NLR抗病基因，研究发现Yr87/Lr85包含两个不同的LRR（亮氨酸富集重复）结构域，并且该基因仅存在于沙融山羊草和高大山羊草中。等位基因挖掘和系统发育分析表明，Yr87/Lr85在这两种物种之间发生了多次基因流动，其存在/缺失变异可以解释这两种物种对小麦叶锈病的主要抗性来源。Yr87/Lr85的分布仅限于沙融山羊草和高大山羊草，以及它在小麦中对Pst和Pt的抗性，突显了这些物种作为小麦抗病基因资源的重要潜力，有助于小麦的抗病性改良。结果：
克隆来自沙融山羊草的 Yr87/Lr85 基因
沙融山羊草（Aegilops sharonensis，材料编号 AEG-548-4）的抗叶锈病和条锈病特性此前已被渐渗入小麦品种Galil，并定位到 D42 渐渗系第6B-6Ssh染色体区段的一个17Mb区域中（图1a）。为了分离候选抗性基因，作者对D42系的3086粒种子进行了EMS（甲基磺酸乙酯）诱变，获得了1158个M2 家系。在利用对 D42 亲本系表现为无毒力的叶锈菌分离小种（Pt #526-24）和条锈菌分离小种（Pst #5006）进行分步筛选后，作者鉴定出16个对两种菌株均感病的独立M3家系（补充图1）。通过诊断性PCR确认，所有16条感病M3系均保留了渐渗入的染色体片段（补充图2）。此外，将一个Pt/Pst感病的纯合体与一个Pt/Pst抗病的M3纯合体杂交，其F2后代表现出单基因分离（1感病 : 3抗病）的性状分离（补充表1）；而感病纯合体与小麦品种Galil杂交的后代则全部为感病。这些结果共同表明，对这两种病原菌的抗性是由单一遗传位点赋予的。为了分离该基因，作者采用了突变转录组学方法，使用了五个EMS突变体（补充表2）、其D42亲本系以及R基因供体沙融山羊草AEG-548-4。作者用Pt #526-24和Pst #5006菌株接种这些材料，并分别在接种后0小时、24小时和48小时采集叶片样品提取RNA。通过RNA测序与数据处理，作者筛选出在D42和AEG-548-4中至少一个或更多时间点表达，并在五个突变体中至少三个含有EMS突变的候选基因。分析最终筛选出一个最有潜力的候选基因TRINITY_DN6116_c0_g1（补充数据1和2）。该转录本在所有时间点均有表达，在五个突变体中均发现突变（其中一个突变体含有两个突变），并编码一个含有核苷酸结合位点（NBS）和亮氨酸富集重复（LRR）结构域的蛋白质。所有单核苷酸多态性（SNP）均位于相同的编码序列（CDS）内，且引起了氨基酸的替换（图1a和补充表3）。为了进一步分析非编码区，作者进行了染色体分选和测序，获得了高质量的突变染色体富集序列。将这些序列比对到高深度测序的 D42 基因组组装（补充表4），发现三个基因组片段覆盖了候选基因的完整序列（补充数据3）。为了验证候选基因的功能，作者使用了病毒诱导基因沉默（VIGS）方法。通过靶向两段非重叠的基因特异性序列对D42系中的候选基因表达进行沉默处理（图1a和补充数据4）。VIGS植株中候选基因的表达量减少超过75%（图1b），且对Pt #526-24和Pst #5006菌株均表现出感病（图1c），证实该基因对叶锈病和条锈病的抗性是必需的。作者暂时将候选基因命名为Yr87/Lr85。为了预测YR87/LR85蛋白的结构，作者生成了其预测结构的三维模型（图1d）。预测的YR87/LR85蛋白具有与典型CC-NLR蛋白相似的结构特征，包括一个常规的 NBS 结构域和一个异常延长的（36次重复）马蹄形终端 LRR 结构域。相比之下，以往克隆的NLR抗性基因的LRR重复数通常在6至31之间，平均约为24次重复（补充图3a）。进一步分析表明，该长LRR重复结构由两个预测的马蹄形结构组成，中间以一个短的间隔序列分隔。EMS突变体中的所有氨基酸替换均位于预测的YR87/LR85功能域内（图1a，d和补充表3）。其中两处突变位于LRR结构域的外部表面（补充图3b），这是一个可能促进病原识别的多样化热点区域。两个EMS突变体的第一个LRR结构域中发生突变，导致对Pt和Pst菌株的抗性丧失。这一发现表明，LRR结构域可能赋予对不同病原菌的抗性。
![]()
·图1 | 沙融山羊草Yr87/Lr85的克隆与功能验证。
a D42渐渗系中Yr/Lr位点的遗传图（cM）和物理图（Mb）。b VIGS（病毒诱导的基因沉默）处理后D42中Yr87/Lr85的表达水平。c VIGS靶向Yr87/Lr85的5′UTR和第二外显子后D42对叶锈病和条锈病分离小种的反应。d AlphaFold2预测的YR87/LR85蛋白结构。
克隆来自高大山羊草的Yr87/Lr85 基因
为了寻找额外的抗锈病基因，作者筛选了一个由244份高大山羊草（Aegilops longissima）材料组成的多样性群体，分别用两种小麦叶锈菌（Pt）分离小种#12460和#12337对幼苗进行接种（方法详见文献）。两种分离小种的接种结果相似，多样性群体中约30%的材料对叶锈菌表现出抗性（图2a）。为鉴定叶锈病抗性候选基因，作者采用AgRenSeq方法，结合pan-cereal NLR捕获文库（Tv_3）和两种叶锈菌分离小种的表型数据。通过Illumina短读序列对所有244份材料进行从头组装，使用NLR-Parser过滤序列，并对137份具有明确表型的材料进行基于k-mer的关联遗传分析。作者发现，对这两种叶锈菌分离小种的抗性与两个contig（71,128和71,798）的存在相关联（补充数据5）。这两个contig定位在参考基因组中未映射的区域（“未知染色体”）。为了精确定位抗病基因，作者使用PacBio技术对高大山羊草参考材料AEG-6782-2进行重测序，并生成了改进的基因组组装（补充图4），其contig N50为16 Mb。通过Hi-C数据对组装进行排序，生成了7条拟染色体，总长度为5.9 Gb（占已组装序列的98.6%），仅包含67.8 kb的间隙，而基于短读数据的初始组装包含931.4 Mb的间隙。改进后的组装使作者能够将两个AgRenSeq NLR候选contig定位到6S染色体的一个开放阅读框，区域为51,756,423–51,772,629（长度16,207 bp）（图2b）。令人惊讶的是，将高大山羊草叶锈病抗性基因与沙融山羊草Yr87/Lr85基因的序列比对后发现，这两个基因几乎完全相同（补充数据6）。它们的长度均为16,207 bp，包含三个高度相似的内含子，并具有几乎完全一致的外显子，外显子间仅有三个同义核苷酸替换，编码一个4533 bp的编码区（CDS），对应一个1510个氨基酸的预测蛋白质（补充数据7）。因此，作者通过两种不同的方法，独立克隆出了来自沙融山羊草和高大山羊草的同源抗锈病基因。为了验证来自高大山羊草的Yr87/Lr85 基因在抗条锈病（Pst）和叶锈病（Pt）中的功能，作者在小麦品种Fielder中表达了高大山羊草Yr87/Lr85的cDNA或包含四个外显子及缩短的内含子的合成基因组DNA（gDNA）克隆，两者均带有原始启动子和终止子（方法详见文献，细节见图2c及补充图5）。作者生成了独立的T0初代转基因事件，选择了分别具有不同拷贝数的三个cDNA转基因系和三个合成gDNA转基因系（补充表5），获得了T1和T2纯合后代，并测试了它们对Pt和Pst菌株的感染反应。三条cDNA转基因系对Pt（#526-24和#12460）和Pst（#5006）菌株均表现为感病，而三条gDNA转基因系表现出不同程度的抗性（图2d）。通过反转录定量PCR（RT-qPCR）分析发现，cDNA转基因植株中的 Yr87/Lr85 表达水平比gDNA转基因植株低至少2.5倍，比高大山羊草中的表达水平低约6倍（图2e）。cDNA转基因系的相对低表达表明，内含子在 Yr87/Lr85 基因的正常表达中起重要作用。此外，Yr87/Lr85 基因在受感染植株和未受感染植株中的表达水平没有显著差异（图2f），且其赋予的抗性在较高温度（28 °C白天/22 °C夜间）下未受影响（补充图6）。作者还用两种Pt（TNBJS和MNPSD）和Pst（v-37和v-40）分离小种对两个额外的转基因系进行了测试，这些分离小种来自北美（美国），发现这些系表现出较高的抗性水平（补充图7）。为了检测 Yr87/Lr85 是否对其他病原菌提供抗性，作者用两种小麦杆锈菌（Pgt，#2135和#2127）和三种小麦白粉菌（Bgt，#15、#70和#101）分离小种对Fielder转基因植株进行了接种。所有这些分离小种均表现为具毒力（补充图8），表明 Yr87/Lr85 特异性赋予了对Pst和Pt的抗性。
![]()
图2 | 高大山羊草Yr87/Lr85的克隆与功能验证。
a 在137个高大山羊草材料中叶锈病抗性的分布。b 使用Pt分离小种#12337鉴定Yr87/Lr85基因。c 转化小麦品种Fielder所用基因构建的示意图。d 典型转基因株系对Pt和Pst分离小种感染的反应。e Yr87/Lr85基因在gDNA（T-g）和cDNA（T-c）转基因株系相对于野生型Fielder和高大山羊草AEG-6782-2（苗期）的相对转录水平。f 在未感染（绿色）或感染后（蓝色）叶片中（接种Pt分离小种#12460后），Yr87/Lr85基因在苗期的相对转录水平。
Yr87/Lr85 在幼苗和成株中赋予定量抗性
为了研究Yr87/Lr85介导的抗性机制，作者用叶锈菌（Pt）和条锈菌（Pst）分离小种接种野生型小麦和携带Yr87/Lr85的转基因Fielder小麦植株，然后用FITC标记的小麦胚凝集素（WGA）对叶片样品进行染色，WGA专门染色真菌细胞壁。结果显示，Pt和Pst分离小种能够侵入并在抗病植株的叶组织中生长，但真菌的发育明显受阻，在感病的Fielder品种中真菌占据的面积显著更大（图3a–c）。在高大山羊草感病和抗病材料中得到了相似结果（补充图9）。这种抗性反应在苗期和成株期中表现一致（图3a），且这一共同的表型与Yr87/Lr85基因在苗期和成株期中相似的表达水平相对应（补充图10a）。此外，Yr87/Lr85基因在大多数组织中均有表达，但根部除外（补充图10b）。通过用二氨基联苯胺（DAB）对活性氧（ROS）进行染色发现，转基因植株中累积的ROS水平低于野生型Fielder植株，但DAB染色覆盖的面积更大，表明存在定量防御反应（补充图11）。作者得出结论：Yr87/Lr85通过减缓病原菌的发育来阻碍Pst和Pt的感染（图3b、c和补充图9），虽然它不能完全阻止真菌的生长，但能够有效防止苗期和成株发病。
![]()
图3 | Yr87/Lr85赋予苗期和成株期抗性。a 小麦品种Fielder和表达高大山羊草Yr87/Lr85的转基因植株在苗期和成株期叶片上的锈孢子堆发育情况。b 光学显微图和 c 荧光显微图显示接种Pt或Pst后的小麦苗期叶片切片。
Yr87/Lr85 仅存在于沙融山羊草和高大山羊草中
作者在其他物种中寻找了Yr87/Lr85的同源基因。在使用Yr87/Lr85的编码序列（CDS）作为查询对象，对高大山羊草基因组v2.0（AEG-6782-2）进行本地BLAST搜索时，发现Yr87/Lr85在高大山羊草基因组中以单拷贝形式存在；而已发布的沙融山羊草基因组中未包含Yr87/Lr85的同源基因。为了理解Yr87/Lr85相对于已知NLR编码基因中的关系，作者基于NLR的NBS结构域，进行了大规模系统发育分析，分析物种包括：粗山羊草（Ae. tauschii）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、大麦（Hordeum vulgare）、水稻（Oryza sativa）、谷子（Setaria italica）、高粱（Sorghum bicolor）、普通小麦（Triticum aestivum）、乌拉尔图小麦（T. urartu）和玉米（Zea mays），分析方法基于 Bailey 等人的研究。YR87/LR85位于C24进化分支的一个亚分支中，而该亚分支不包含已知的抗病基因（补充图12a）。水稻PI5-1/PI5-2和PII-1/PII-2抗病基因与YR87/LR85处于姐妹亚分支中。使用全长的NLRs序列进行系统发育分析显示，YR87/LR85所属的亚分支仅在BOP进化支（包括竹亚科、稻亚科和早熟禾亚科）中发现相关物种（补充图12b）。该基因的直系同源组包括四个NLR基因：YR87/LR85、粗山羊草EMT11349（RGA1，抗病基因同源序列1）、大麦HORVU.MOREX.r3.3HG0316460.1和乌拉尔图小麦TRIUR315482P1（补充图12b）。在NCBI和禾本科特定数据库中以Yr87/Lr85的CDS为查询对象进行的全局BLAST搜索显示，其植物物种中的序列相似度与三个族群相关：小麦族（Triticeae）、早熟禾族（Poeae）和短柄草族（Brachypodieae）（补充数据8）。作者进一步在六倍体小麦及其D基因组祖先粗山羊草中搜索了Yr87/Lr85的同源基因（补充表6）。与Yr87/Lr85序列相似性最高的两个基因分别是粗山羊草的假定抗病基因RGA1（与Yr87/Lr85的CDS序列相似度为87%）和乌拉尔图小麦的RGA2-like假定抗病基因（核苷酸相似度为83%）。所有其他预测基因的序列相似度低于80%或覆盖率低于80%。有趣的是，以YR87/LR85的预测蛋白序列为查询对象进行的全局BLAST搜索显示，只有粗山羊草RGA1蛋白的相似度达到79%，其余序列的相似度均低于65%（补充数据9）。综合来看，Yr87/Lr85属于BOP物种中NLR的大进化分支，其推定的直系同源基因仅在小麦族的三个物种中发现。为验证粗山羊草RGA1是否为Yr87/Lr85的功能同源基因，作者测试了15份粗山羊草材料（其中8份携带RGA1，7份不携带RGA1）对叶锈菌分离小种#526-24的反应，结果未发现RGA1的存在与材料抗性的相关性（补充表7）。为了进一步验证，使用VIGS抑制RGA1基因（补充数据4）在粗山羊草材料AEG-9907-0中的表达，发现与空载体接种的植株相比，RGA1沉默植株对叶锈菌分离小种#526-24的反应无差异，进一步表明粗山羊草的RGA1并非Yr87/Lr85的功能同源基因（补充图13）。基于 YR87/LR85 预测的完整蛋白序列、LRR和NBS结构域的序列以及已克隆NLR基因的蛋白序列进行的系统发育分析显示，YR87/LR85蛋白与小麦TSN1（ToxA敏感性蛋白）最为接近（补充图14和补充数据10）。然而，当使用CC结构域进行查询时，作者只发现低的序列相似度，这表明YR87/LR85 的CC结构域与已克隆的NLR基因不同。通过FoldSeek数据库进行的结构同源性分析显示，YR87/LR85蛋白的预测结构与若干预测的NLR类抗病蛋白具有部分结构相似性（补充图15），但所有这些候选蛋白在C端均无同源性，并且此分析未揭示新的功能或系统发育信息。因此基于以上分析，作者未能在现有数据库中发现沙融山羊草和高大山羊草Yr87/Lr85的功能同源基因。沙融山羊草生长在地中海东部沿海一条宽度超过15公里的狭窄地带，与分布更广泛、可以深入内陆和向南延伸的高大山羊草有重叠区域。为全面分类Yr87/Lr85在沙融山羊草和高大山羊草中的等位基因多样性，作者使用了基于RenSeq数据的迭代从头组装和k-mer指纹分析，研究了204份沙融山羊草和244份高大山羊草的材料。Yr87/Lr85表现为存在/缺失变异，其中沙融山羊草中36%的材料（73/204）含有该基因，高大山羊草中为21%（52/244）（补充数据11）。根据开放阅读框的变异（沙融山羊草19种等位基因，高大山羊草18种）和氨基酸序列（沙融山羊草17种变异，高大山羊草15种），可以鉴定出多个等位基因。大多数等位基因特有于单一物种，其中44%仅存在于单一基因型中，只有四种等位基因在沙融山羊草和高大山羊草间共享。总共有24%的基因型包含与其他物种共享的等位基因（补充表8）。几个等位基因带有中断的开放阅读框，包括AEG-2172(AGSH008), AEG-7888(AGSH010), AEG-2229(AGSH054), AEG-2704 (AGSH057)和AEG-4844 (AGSH060)。有趣的是，尽管Yr87/Lr85的等位基因AEG-401[AGSH039]被沙融山羊草和高大山羊草共享，但是似乎表现为非功能性的，因为它在第二个外显子有个插入可能影响了基因的表达（补充数据12）。基于与YR87/LR85序列一致性的等位基因分类表明，沙融山羊草和高大山羊草中对小麦叶锈病的多数抗病性可以通过YR87/LR85解释（图4a和4b）。在高大山羊草中，预测携带功能性Yr87/Lr85等位基因（上述转基因株系中赋予抗性的等位基因）的35个材料中，有31个（88.5%）对小麦叶锈菌分离小种#12460表现抗病（IT为1-3），而4个材料表现为感病（IT为7-9）（补充数据12）。对于166个预测携带非功能性Yr87/Lr85或Yr87/Lr85缺失的材料，其中22个表现抗病（IT为1-3），2个显示中间型评分（IT为5），142个表现为感病（IT为7-9）。在沙融山羊草中，预测携带功能性Yr87/Lr85等位基因的44个材料中，只有28个（63%）对小麦叶锈菌分离小种THBJ35,54表现抗性（IT为1-3），而16个表现为感病（IT为7-9）（补充数据13）。对于100个预测携带非功能性Yr87/Lr85或Yr87/Lr85缺失的材料，其中31个表现抗病（IT为1-3），3个显示中间型评分（IT为5），66个表现为感病（IT为7-9）。在具有完整开放阅读框的等位基因之间，观察到的序列变异很小，与功能性等位基因相比，最大差异仅为四个氨基酸。重组分析未发现Yr87/Lr85 CDS等位基因之间的任何重组事件。推测的等位基因最大似然（ML）系统发育树（图4c）未显示沙融山羊草和高大山羊草等位基因之间的明显分离。没有任何高阶分支特定于某一物种。此外，未观察到明显的地理分布模式，除了系统发育树底部根部的一个分支来源于北方。此外，在18%的等位基因中，相同等位基因的材料出现在75公里以上的距离内；而在75%拥有多个材料的采集点中，存在2到4种不同的等位基因。这一模式表明，这两个物种之间可能发生了几次水平基因转移事件，并且可能存在为了保持群体内该基因多样性的进化压力。
![]()
图4 | Yr87/Lr85在沙融山羊草和高大山羊草群体中解释了对小麦叶锈菌的大部分抗性，并经历了水平基因转移。a 基于等位基因的表型分析。b 基于等位基因的表型分析。c 基于等位基因序列的最大似然（ML）树。
讨论
多抗性通常由具有广泛功能的非NLR型R基因介导，Yr87/Lr85是一种罕见的克隆NLR基因的例子，在小麦中同时对两种不同病原菌提供抗性。Yr87/Lr85并未阻止宿主侵染，也未完全阻断病原菌的生长，但显著减缓了病原菌的发育并防止了病害的进一步进展，类似于成株抗性或慢锈性。然而，Yr87/Lr85是一个全生育期抗病（ASR）基因。Yr87/Lr85对杆锈菌或白粉菌无效，因此其抗性范围不如Lr34/Yr18/Sr57/Pm38、Lr46/Yr29/Sr58/Pm39和Lr67/Yr46/Sr55/Pm46。Yr87/Lr85对测试的所有条锈菌和叶锈菌分离小种（包括高毒力小种）均表现出有效抗性，表明其在育种计划中具有较高潜力。Yr87/Lr85 的表达是组成型且稳定的，不受病原体是否存在、植株的发育时期或温度的影响，它所提供的抗性在苗期和成株期同样有效。关于Yr87/Lr85如何对两种不同病原菌提供抗性，目前尚不清楚。假设其抗性是由识别真菌效应蛋白而触发的，YR87/LR85蛋白可能识别来自两种不同的效应蛋白。基于此，可以排除两个富含亮氨酸重复（LRR）结构域存在差异化作用的可能性。另一种可能是，不同的病原体或许含有一种共同的效应蛋白。由于Yr87/Lr85基因序列在沙融山羊草和高大山羊草中几乎相同，所以目前这两种可能性都是合理的。最后，作者期望随着沙融山羊草和高大山羊草高质量多样性群体以及可靠的基因组资源的可获取性，再结合诸如PacBio这样强大的长读长测序技术以及基于全基因组k - mer的关联作图方法，研究人员将能够系统地探索并快速挖掘这些独特的遗传资源，用以改良小麦及其他谷类作物。
