对数量性状位点（QTL）不同的近等基因系（NILs）进行分析可以有效地对单个基因座进行详细定位和表征。虽然近等基因系可用于遗传和生理研究，但开发这些系所需的时间和精力限制了它们的使用。本研究描述了一个策略，可以用分子标记或其他遗传标记进行分析来定位近等基因系基因组的任何区域。该策略利用分子标记来鉴定分离感兴趣的基因组区域的杂合自交系（HIFs）。每个HIF在基因组中的大多数基因都是相同的，但可以从分离家系中提取出与感兴趣的QTL连锁的标记不同的近等基因系。该策略应用于两个与高粱粒重相关的QTL。用来自与粒重相关的不同连锁群的两个RAPD标记对98个HIF群体进行筛选，并筛出三个分离家系。这些HIF的后代的特征在于粒重和其他产量组分的分离以及每个QTL侧翼的标记。来自HIF的近等基因系具有显著不同的粒重，证实存在至少两个影响高粱粒重的基因。![]()
（1）粒重QTL的鉴定
高粱作图群体的单因子QTL分析确定了基因组中与粒重变异相关的两个区域。在一个连锁群上，umc84是与，粒重最紧密相关的标记，来自B35亲本的等位基因与较高的粒重相关，该QTL的加性效应估计为0.21g/100粒种子。在另一个连锁群中，tH19/50是与粒重QTL紧密连锁的标记。在该位点，来自TX7078的等位基因与较高的粒重相关，该位点的加性效应估计为0.15g/100粒种子。开发了在这些QTL上不同的近等基因系以进一步表征这些位点。![]()
图1 高粱两个连锁群的RAPD和RFLP标记连锁图
表1利用RAPD和RFLP标记对重组自交群体粒重进行关联分析并鉴定出两个粒重QTL
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（2）近等基因系的开发和表征
近等基因系是通过筛选杂合自交系（HIFs）来鉴定与每个QTL关联最紧密的RAPD标记的杂合家系。用RAPD标记tH19/50和t329/132筛选F5:8HIFs的后代。RAPD标记用于初步筛选的HIF，因为最初的基因型评价的映射群体只包含RAPD标记。经RAPD标记筛选，umc84定位于该区域。显示HIFs 13、47和48对于标记t329/132是分离的，并且HIFs 36、66和96对于标记tH19/50是分离的。对每个HIF衍生的8个后代株系的粒重进行测定，以确定粒重与分离标记之间的关联。在分离t329/132的HIF中，携带来自B35的等位基因的家系比具有来自TX7078的等位基因的家系具有显著的更高的粒重。对分离tH19/50的HIF的分析表明，携带源自TX7078亲本系的等位基因的家系比携带来自B35的等位基因的家系具有显著更高的粒重。对于这两个位点，RAPD标记和粒重之间的关联与先前的作图群体的结果一致。![]()
图2 从非固定的重组自交群体中产生杂合自交系
通过分析从每个HIF中选择的一组4个近等基因进一步表征这些粒重QTL。平均每组近等基因系中有6.41%的标记是杂合的，从而证实了这些系的遗传相似性。这与F5祖先系中预期的6.25%杂合性一致。这些品系的特征在于种子重量、谷粒产量和每株植物种子数的差异。对包含t329/132的近等基因系的评价表明，在源自HIFs 13和48的家系中，与标记相关的平均粒重存在显著差异。在HIF47衍生的近等基因系中也观察到类似的表达模式，但粒重的差异不显著，平均籽粒产量和每穗粒数也存在较大差异。意外的是，谷粒产量和粒数的表达模式在所有近等基因系中并不一致。在来自HIF13和HIF47的近等基因系中，B35等位基因与较高的籽粒产量和种子数相关，但在来自HIF48的近等基因系中，TX7078等位基因与较高的产量和种子数相关。尽管在不同组的近等基因系中谷粒产量和种子数的表达存在差异，但粒重的表达始终与t329/132相关，证实了在该标记附近的粒重QTL的作用。![]()
图3 利用RAPD标记t329/132筛选杂合自交系的后代
对t329/132侧翼标记的分析表明，近等基因系组内和组间存在相当大的异质性。这一异质性为QTL的精细定位提供了重要信息。将单个家系的粒重差异与t329/132附近的重组事件进行比较，粒重在HIF13中与t329/132共分离，在HIF47中与umc84共分离，在HIF48中在t329/132和umc84之间。这些结果表明，粒重的QTL位于标记t329/132和umc84之间。表2 来自t329/132分离的HIF的近等基因系中粒重、籽粒产量和单株种子数的差异
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以tH19/50为对照的近等基因系的遗传和表型分析也表明标记的分离与粒重之间存在显著的相关性。来自HIFs36和66的近等基因系中标记和平均粒重之间的关联与在原始作图群体中观察到的一致。在这些系中，粒重的变化似乎与籽粒数量的差异有关。该QTL可能调节种子数量的变异性，与种子重量变异性的关联可能是由于光合产物的再分配。尽管这些近等基因系在粒重和籽粒数上存在差异，但它们在籽粒产量上的相似性与这一假设是一致的。
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图4 标记t329/132分离的HIF分离的NIL的基因型
（3）杂合自交系分析
HIF分析是用于鉴定在所选标记或基因组区域上不同的近等基因系的步骤。HIF可以从早代或高代自交系的群体产生。如果近等基因系来源于自交程度更高的种群，它们的同质性会更高。但这一优势必须通过筛选更大的群体来确定分离家系。分离家系在早代自交群体能被鉴定到在一个较高的频率。然而，来自这些家系的近等基因系的相同基因较少，其他基因分离导致的表型变异可能掩盖QTL的表达。从早代或晚代自交系中开发HIF将取决于必须筛选以鉴定用于比较特定QTL的近等基因系的家系的数目以及评估QTL效应所需的遗传相似性的程度。在大多数研究中，从F5或F6代自交系中鉴定的HIFs中鉴定的近等基因系应该在待筛选群体的大小和所得品系的遗传相似性之间提供合适的折衷。在本项研究中，最初的基因型分析的作图群体只包括RAPD标记。在筛选HIF时需要进行后代检测，因为RAPD是显性标记。HIF分析的一个更有效的策略是在杂合自交作图群体中使用共显性标记进行QTL定位。一旦通过连锁分析鉴定出所需性状的标记，对作图群体中的标记基因型的调查将指示对于目标基因组区域是杂合的或异质的家系。在这些基因组区域形成对比的近等基因系可以通过评价这些系的自交后代容易地鉴定。HIF分析有几个应用。首先，可以通过检查来自分离家系的近等基因系的表型来确认与QTL的标记连锁。在定位群体中标记与性状的连锁以及近等基因系中表型的确认为QTL的定位和效应提供了有力的证据。从大量的HIF中提取近等基因系也很容易，这使得QTL定位在低显著性阈值下，可以通过随后的近等基因系检测来确认。其次，从分离的HIF中提取的近等基因系可用于QTL的精细定位。每个分离的HIF是独立的，并且在QTL侧翼的基因组区域中包含独特的重组事件，这些重组可以确定已知含有QTL的遗传区间。第三，在QTL处不同的近等基因系可用于表征特定基因的表达和功能。可以从不同的重组系中提取近等基因系，从而可以将QTL最佳表达的遗传背景用于基因的表型表征。这将缓解QTL评价中上位互作或互作性差所导致的问题。HIF分析用于QTL评价的局限性之一是由HIF衍生的近等基因系的遗传背景是独特的，并且不容易被重复。近等基因系不易用于评价单一遗传背景下多个QTL的效应或比较不同群体中QTL的效应。在近等基因系中QTL分析的另一个重要考虑因素是统计功效。在本项研究中，连锁分析的重组自交作图群体标记和粒重之间的高度显著的关联。随后对这些QTL在近等基因系中的分析表明表型存在差异，但统计学显著性水平较低。这可以通过比较NILs和RI系中QTL的统计功效的差异来解释。在RI群体中，每个标记等位基因在不同的遗传背景中重复多次。标记等位基因的这种内部重复提供了用于测试与特定标记相关的表型差异的统计功效。虽然近等基因系的分析减少了由其他基因分离引起的表型变异，但每个标记等位基因仅由给定的近等基因系组内的一个或几个系代表，这会导致用于检验表型差异的统计功效降低。统计检验的功效可以通过评估在单个基因上对比的几组近等基因系和通过增加每个近等基因背景内的系的数目来增加。增加NIL的重复也可用于增加统计检验的功效。这种对检验近等基因系间表型差异的统计功效的考量可能会限制使用这种方法进行小效应QTL精细定位的潜力。本研究描述了一个利用分子标记来评估一个HIFs群体来确定近等基因系不同的两个QTL与粒重的关系的方法。每个标记位点分离出三个HIF，并描述了从这些HIF中选择的近等基因系的遗传和表型特征。这是一个为发展近等基因系并对比特定的QTL有用的方法，特别是对自花授粉作物。
