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由小麦条锈菌Puccinia striiformis f. sp. tritici
(Pst)引起的条锈病严重影响了小麦生产。克隆抗条锈病基因对于高效培育抗条锈病小麦品种至关重要。在已知小麦条锈病抗性基因Yr10的基础上，克隆了一个抗性基因( Yr10CG )。然而，随后的单倍型和连锁分析表明，在Yr10位点附近存在额外的抗性基因。利用 STAM 克隆了该区域的条锈菌抗性基因YrNAM。Yr NAM编码一个具有NAM结构域和 ZnF - BED结构域的非典型抗病蛋白，并证明这两个结构域都是抗病所必需的。YrNAM的内源启动子驱动的转基因小麦对条锈菌小种CYR32和CYR33具有抗性。YrNAM是一个古老的基因，存在于小麦野生种Aegilops longissima 与 Ae. sharonensis中，在大多数小麦品种中并不存在，表明其具有较大的育种价值。研究背景
由小麦条锈菌Puccinia striiformis f. sp. tritici
(Pst)引起的小麦条锈病是一种毁灭性的小麦病害，对全球小麦生产构成威胁。克隆抗病基因对于研究小麦与锈菌互作至关重要，可以加快小麦抗条锈病的育种进程。然而，在小麦中已报道的86个抗条锈病( Yr )基因中，仅有7个Yr基因被克隆，且多来自图位克隆。将来源于土耳其小麦PI 178383的Yr10转入小麦品Moro和AvSYr10NIL中，能够使其获得全生育期抗性。含有Yr10的小麦品种对CYR29、CYR31、CYR32和CYR33等多个条锈菌菌株具有抗性，但对CYR34敏感。先前报道了一个CC-NBS-LRR基因( Genbank AF149112 )是Yr10的候选基因。将AF149112转入感病品种可对条锈菌生理小种SRC-84产生抗性，而对条锈菌生理小种CDL-29不产生抗性，CDL-29是一个相当古老的生理小种，相当于PST-29。先前对AF149112 (后称为Yr10CG )进行了单倍型和连锁分析，发现该位点与对CYR29、CYR31和CYR32混合孢子产生抗性的位点相距1.2 cM。由于含有AF149112的转基因小麦对CYR29感病，因此在定位区间内除Yr10CG外的其他基因或位点可能赋予小麦对CYR29的抗性。历史上，抗性基因和其他感兴趣的基因大多采用基于图谱的克隆策略进行克隆，需要遗传图谱和物理图谱，繁琐且耗时。但在大多数外源抗性基因定位的重组抑制区域周围进行精细定位是困难的。基于克隆、DNA或RNA测序并利用独立突变体克隆候选基因的方法随之出现。这些方法针对特定的染色体或特定类别的基因，从而避免了其余基因组的干扰。此外，这些方法不需要遗传图谱。最近，利用基于测序的方法已经克隆了多个抗锈病基因。例如，Yr7，Yr5 / YrSP，Sr22，Sr26，Sr45和Sr61被MutRenSeq所克隆；利用MutChromSeq方法克隆了Sr43基因；利用MutRNASeq克隆了Sr62。然而，这些方法都有不同的局限性。例如，MutRenSeq只适用于核苷酸结合和富含亮氨酸重复序列( NLR )基因的克隆；MutChromSeq对流式细胞仪染色体分选步骤有较高的需求；MutRNASeq则需要高质量的野生型( WT )基因组组装。本研究利用STAM的方法克隆了小麦抗条锈病基因YrNAM。STAM以野生型IsoSeq为参考，利用相关突变体的转录组测序进行基因克隆。发现YrNAM编码一个具有NAM结构域和ZnF-BED结构域的蛋白。YrNAM在大多数小麦品种中不存在，但在野生种Aegilops longissima和Ae. sharonensis中存在。研究内容
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STAM可以通过突变体和RNA-Seq克隆感兴趣的基因
为了执行STAM，全长WT转录本用于生成非冗余转录本的参考。然后，将功能缺失突变体的RNA-Seq reads映射到参考序列上，并统计突变转录本的数量(图1a )。在本研究中，一个具有Pst抗性的WT（P10–46）和七个Pst敏感的M3株系(图1b )被用来进行STAM。利用STAM技术在7个独立突变体中共鉴定到7434个高可信的突变位点（G>A和C>T），其中一个转录本T59230在除M62之外的6个独立突变体中均存在点突变；进一步分析发现，突变体M62的后代出现了抗条锈病和感条锈病的分离，感病后代中在T59230转录本上同样存在一个G>A的突变。同时，我们还对其余5个感病突变体进行了检测，同样在T59230转录本上鉴定到了5个额外的点突变，这些突变均造成了氨基酸的改变。总的来说，所有12个感病突变体都在T59230位点发生了突变(图1c )。因此，T59230是抗条锈病的候选位点。YrNAM是一个具有NAM和ZnF-BED结构域的抗条锈病基因
T59230 CDS全长1227 bp，序列比对发现其由5个外显子组成(图1c )。预测蛋白YrNAM在N端和C端分别具有一个NAM结构和一个ZnF-BED (BED锌指)结构。YrNAM-GFP融合蛋白在烟草叶细胞核中表达。突变分析表明NAM和ZnF-BED结构域都是抗性所必需的；12个EMS功能缺失突变体中有6个在NAM结构域发生突变，另外6个在ZnF-BED结构域发生突变(图1c )。YrNAM与野生型P10-46的抗病性共分离
为了进一步验证YrNAM在野生型P10-46中赋予的条锈病抗性，利用P10-46和一个条锈菌感病突变体M19构建了F2群体。利用M19中YrNAM的C2076T突变，开发了一个独特的诊断标记YrNAM-F8R，113株F2代幼苗对条锈病的抗与按3：1分离；YrNAM-F8R2与条锈病感病基完全连锁。在重新定位Yr10区域的同时，创制了包含126个家系的F2：3群体和7177个F2：5的精细定位群体。在126个植株中，显性PCR标记YrNAM - F8R7扩增出YrNAM基因3′端698 bp的片段，与Yr10共分离标记Xsdauw7完全连锁。利用精细定位群体中获得的37个Xpsp3000 - Xsdauw79区间的重组体，发现YrNAM-F8R7与来自Moro的条锈病抗性共分离。![]()
转基因材料对条锈病具有抗性
构建了YrNAM表达载体(图2a )，并将其转化到小麦条锈菌感病品种Fielder和CB037中。用条形柄锈菌生理小种CYR32对Fielder# 3、CB037 # 4和CB037 # 5等3个品系每系20粒T1代种子进行检测。每个T1的侵染类型(
ITs )与YrNAM的表达量相关。Fielder和CB037中表达Yr NAM的T1植株对CYR32均为免疫( ITs = 0)或高抗( ITs = 1-2)，而未表达YrNAM的T1和阴性对照植株均为高感( ITs = 7 ~ 8) (图2b , c)。在T2代中，PC1213转基因植株表现出对Yr NAM无毒小种CYR33的抗性，如Moro、P8-13和P10-46(图3a )。然而，CYR34对YrNAM具有毒性，在Moro、P8-13和P10-46中大量产孢(图3b )。出乎意料的是，PC1213转基因T2代植株对CYR34表现为抗( ITs
= 2) (图3b )，这可能是由YrNAM与Fielder中的Yr6和CB037中的Yr9叠加引起的。野生型Fielder对CYR34表现为中抗，表现为轻微的过敏性反应( HR ) (图3b )。![]()
在中国春1B(IWGSC, RefSeq v2.1)染色体上，YrNAM与TraesCS1B03G0003600LC.1和TraesCS1B03G0003500LC.1同源，与Yr10的诊断标记Xsdauw79 ( TraesCS1B03G0003800 ) 相邻，距TraesCS1B03G0000200
( AF149112)约1.0 Mb。1A和1D染色体上的YrNAM同源基因在抗性野生型P10-46、Moro和7个YrNAM缺陷突变体的RNA - Seq数据中均未检测到。这些同源物仅在公共数据中低表达。ZnF-BED结构域在这些YrNAM同源基因中高度保守，尤其是在1A、1B和1S染色体上注释的基因之间。而在禾本科中，6个NLR-BED抗病基因的YrNAM与ZnF-BED结构域的一致性为37 - 44 %。系统进化树分析表明，YrNAM的ZnF-BED结构域与禾本科中NLR蛋白的ZnF-BED结构域明显不同。因此，YrNAM中的ZnF-BED结构域插入与NLRs
Rph15和Yr5 / Yr7中的ZnF-BED结构域插入无关。Yr NAM在大多数小麦品系中缺失
为了明确YrNAM在栽培小麦中的分布情况，我们从659份小麦材中筛选到60份含有AF149112的株系。4个品系(丰麦2号、阜繁24、鲜食心麦、湘农3号)对YrNAM - F8R呈阳性，对YrNAM-F1R和YrNAM-F02R呈阴性。然后，筛选了另一批小麦种质，包括578个中国品种和育种品系以及59个匈牙利品种；其中均未检测到YrNAM。YrNAM在大多数小麦中的普遍缺失可能是由于其与一个非期望性状褐颖位点Rg1紧密连锁造成的。
