由小麦柄锈菌（Puccinia Triticina Eriks，Pt）引起的叶锈病（LR）是世界范围内小麦的一种毁灭性叶部真菌病害。利用抗病基因提高植物免疫力是最经济、最生态有效的减轻叶锈病损失的方法。因此，发现更多的抗性资源来应对病原菌中的小种变异是很有必要的。大多数LR抗性基因是小种特异性的、全生育期抗性（ASR）基因，通常具有强烈的超敏性。相反，大多数成株抗病基因（APR）的特点是慢锈表型和非小种特异性，越来越受到育种家的注意。而普通小麦品系4N0461表现出成株抗叶锈病。![]()
2024年8月13日，中国农业大学分子设计育种前沿科学中心在《Theoretical and Applied Genetics》在线发表了题为“Fine‑mapping of LrN3B on wheat chromosome arm 3BS, one of the two complementary genes for adult‑plant leaf rust resistance”的研究论文，研究主要内容和结果如下：（1）4N0461在成株期对叶锈病的抗性
在田间成株期，4N0461表现出对Pt小种PHT的强抗性，没有或很少有夏孢子。高温增强了抗性反应;在20℃的温室中，4N0461从六叶期开始显示抗性，但在30℃下进行测试时，抗性从五叶期开始表现。 ![]()
图1 不同小麦材料对叶锈病小种PHT的反应
（2）4N0461互补抗病基因的遗传分析
4N0461×农大4503的F2分离出241个抗、201个感病群体，4N0461×石4185的F2分离出216个抗、200个感病群体。两个分离比均符合抗：感=9：7(χ2=0.60和3.16），表明抗性由两个互补的显性基因赋予。对441个4N0461×农大4503×F2：3家系的检测结果也符合互补基因模型的期望分离比纯抗：分离：感病=1：8：9（χ2=1.37）。（3）互补基因在染色体3BS和4BL上的定位
为了分别对互补基因进行定位，我们在4N0461×农大4503中选择了114个R：S=3：1的分离家系。对分离家系的R池和S池进行多态性SSR标记筛选，在4BL染色体上发现了多态性标记Xgwm251，在3BS染色体上发现了多态性标记Xgwm533。推测4N0461中的两个抗病基因位于这两条染色体上，暂将其分别命名为LrN3B和LrN4B。 ![]()
图2 Xgwm251和Xgwm533的F2：3分离家系的抗池和感池之间的SNPs总数
90K iSelect Chip基因分型结果显示，R池和S池之间的SNPs主要分布在3B和4B染色体上。它们富集在染色体3BS的0-30Mb区域和4BL的500-650Mb区域。标记4B116、3B298和3B384基于来自4BL和3BS的SNP富集区的参考序列开发。对4N0461×农大4503杂交的441株F2原始植株进行了染色体4BL上的标记Xgwm251、Xwmc692和4B116以及染色体3BS上的标记Xgwm533、3B298和3B384的检测，分别对LrN3B和LrN4B基因进行基因型分析。标记基因型和表型的关联与互补显性基因的预期一致。 ![]()
图3 抗感池之间的SNPs
根据标记基因型，选择分别携带LrN3B和LrN4B的感病株系9T264和9T265进行杂交。F1植株对叶锈病表现出成株抗性。9T264和9T265与4N0461×农大4503杂交F1植株（9T47）的后代分离比为R：S=1：1。这些结果进一步证实了4N0461中互补抗性基因的遗传和定位结果。根据标记基因型，从单位点分离的家系中选择了301株分离于LrN3B位点的F3植株和312株分离LrN4B位点的F3植株。两个群体均分离为R：S=3：1（χ2=1.55，χ2=0.155，p>0.05）。这两个群体用于单独定位LrN3B和LrN4B。除了已知位于染色体4BL靶区域的标记物Xbarc163和Xgal7390外，还基于双亲的重新测序数据和IWGSC RefSeq v1.1基因组序列开发了更多标记。最后，利用4个新标记3B288、3B95、3B330和3B345（与3B298、3B384和Xgwm533相邻）和6个标记4B96、4B298、4B301、4B342、Xbarc163和Xgpw7390（与Xgwm251、Xwmc692和4B116相邻）分别构建了LrN3B和LrN4B的遗传图谱。LrN3B定位在3B330和Xgwm533之间的1.66cM区间内，LrN4B与Xwmc692共分离，与4B96和Xgwm251在2.08cM区间内。![]()
图4 LrN3B和LrN4B的遗传图谱
（4）LrN3B的精细定位
为了更精细地定位LrN3B，利用来自分离LrN3B的F3杂合的F4植株的较大群体来测试更多标记。根据IWGSC Refseq v1.1参考基因组，3B330和Xgwm533相距1.08Mb。Indel标记3-1、3-9和3-79以及STARP标记3G152从区间中开发。使用7个标记（3B330、3B384、3-1、3-9、3-79、3G152和Xgwm533）对1328株植物进行基因分型。LrN3B位于标记3-1和3G152之间，并与3-9共分离。在侧翼标记之间有13个重组植株。使用来自杂合重组体的另外1445株F5植株，将LrN3B缩小至3-62和3-70之间的0.07cM区间（对应于IWGSC RefSeq v1.1中的106kb）;标记3-19、3-33和3-35与LrN3B共分离。![]()
图5 LrN3B的精细定位
（5）LrN3B候选基因
根据IWGSC RefSeq v1.1基因组，在106-kb间隔中有4个注释基因（从3-62到3-70）：TraesCS3B02G014700、TraesCS3B02G014800、TraesCS3B02G014900和TraesCS3B02G015000编码甘油-3-磷酸酰基转移酶（G3PA）、转导蛋白家族蛋白/WD-40重复家族蛋白（TFP），四肽重复蛋白（TPR）和外壳体亚基beta'-1（CSB）。使用4对引物进行测序，结果显示抗、感基因型之间仅TraesCS3B02G014800和TraesCS3B02G014900不同。4N0461中TraesCS3B02G014800的两个序列（PP274033和PP274034）具有单一SNP（T1754C），农大4503中TraesCS3B02G014800的一个序列与PP274034相同。基于该SNP设计了STARP标记TFPa。利用该标记对4N0461和农大4503分别扩增出两条和一条带，发现该标记与LrN3B共分离。将4N0461中TraesCS3B02G014800的两个序列命名为148A和148B。CS中TraesCS3B02G014800的序列与4N0461和农大4503中148B的序列之间存在88个错配和55个Indels，并且在具有标记TFPa的CS中没有扩增出条带。将CS中的序列变体命名为148C。在4N0461（PP274036）和农大4503（PP274037）中的TraesCS3B02G014900序列之间存在156个错配和28个Indels。由于农大4503中的TraesCS3B02G014900与CS中的TraesCS3B02G014900相同，因此将4N0461（PP274036）中的TraesCS3B02G014900命名为149R，将农大4503和CS中的TraesCS3B02G014900命名为149S。而LrN3B共分离标记3-35正是通过TraesCS3B02G014900中的序列变异设计的。结构域分析表明，4N0461中TraesCS3B02G014800和TraesCS3B02G014900编码的蛋白在N端具有典型的跨膜结构。与148A相比，148B中的SNP（T1754C）引起了V→A氨基酸的改变，但结构域没有发生根本性的变化。4N0461中149R编码的蛋白质在C末端具有三个重复的TPR结构域，这是典型的互作基序。TraesCS3B02G014800和TraesCS3B02G014900因此都是LrN3B的候选基因。![]()
图6 诊断标记分析
（6）通过BSMV-VIGS验证LrN3B候选基因的功能
使用BSMV-VIGS验证4N0461中LrN3B候选基因的功能。PDS基因沉默构建体证实了VIGS系统在4N0461中的功效。用携带靶向TraesCS3B02G014800（TFP）和TraesCS3B02G014900（TPR）的LrN3B沉默构建体的BSMV病毒处理后，4N0461在七叶期对Pt PHT易感，而阴性对照（BMSV：00）没有表现出明显的症状。RT-PCR结果表明，接种BSMV：TFP和BSMV：TPR病毒的叶片中这两个基因的表达量均显著低于阴性对照叶片（p<0.05）。这些结果表明，TFP和TPR基因是LrN3B对LR的抗性所必需的。![]()
图7 利用VIGS对LrN3B候选基因进行功能验证
（7）普通小麦LrN3B基因的序列变异
利用LrN3B的诊断共分离标记（TFPa和3-35）对211份小麦种质进行多态性检测。LrN3B有4种单倍型：LrN3B_h1（148A+148B+149R，11个株系，5.2%）、LrN3B_h2（148B+149R，3个品种，1.4%）、LrN3B_h3（148B+149S，46个株系，21.8%）和LrN3B_h4（148C+149S，151个株系，71.6%）。对与LrN4B共分离的Xwmc692进行基因分型，鉴定出6个可能含有LrN4B+LrN3B的品系：4N0461、农大189、周麦22、周8425B、周麦30和Youbaomai。
本研究在小麦品系4N0461的染色体3BS和4BL上发现了两个互补的显性APR基因（暂命名为LrN3B和LrN4B）。利用4N0461/农大4503的LrN3B位点分离的亚群体对其进行精细定位，将LrN3B在染色体3BS缩小至0.07cM的遗传区间，对应于中国春（CS）参考基因组（IWGSC RefSeq v1.1）的106kb。在该区域共注释了4个基因，其中TraesCS3B02G014800和TraesCS3B02G014900在抗病和感病基因型间存在差异，在BSMV-VIGS实验中，这两个基因都是LrN3B抗性所必需的。TraesCS3B02G014800的共分离标记TFPa和TraesCS3B02G014900的共分离标记3-35可用于检测小麦种质资源中的LrN3B单倍型和标记辅助育种。
