Nature Plants | N-糖基化修饰可直接介导植物细胞膜表面受体复合物激活的新机制

2024年11月7日，华中农大农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室徐曙彤教授团队联合美国密歇根大学单立波教授团队在《Nature Plants》上在线发表了题为“Mechanistic study of SCOOPs recognition by MIK2-BAK1 complex reveals the role of N-glycans in plant ligand-receptor-coreceptor complex formation”的研究论文。该研究综合运用结构生物学、生物化学、分子动力学模拟、质谱学和遗传学等手段阐释了植物免疫受体MIK2识别SCOOP小肽，继而与共受体BAK1组装复合物的分子机制，并首次揭示了N-糖基化修饰可直接介导植物细胞膜表面受体复合物激活的新机制。

研究背景

感知外界环境对于真核生物的发育和防御至关重要。植物部署了一系列细胞表面的受体激酶（RKs），它们能够识别内源性和外源性信号。具有胞外亮氨酸富集重复序列（LRR）结构域的RKs构成了植物中最大的LRR-RK亚组，其中拟南芥有超过220个成员，水稻有超过300个成员。一些LRR-RKs作为模式识别受体（PRRs）来识别病原体或微生物相关分子模式（PAMPs或MAMPs）或宿主来源的损伤相关分子模式（DAMPs），导致模式触发的免疫（PTI）。拟南芥中的受体激酶MIK2是植物内源性丝氨酸富集肽（SCOOP）家族以及广泛存在于多种真菌和细菌中的SCOOP-LIKE（SCOOPL）的真正受体。对SCOOPs的感知诱导MIK2与BAK1或 SERK4 的异聚体化，从而触发一系列的植物免疫反应，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活、活性氧（ROS）爆发和细胞质Ca2+浓度的增加。因此，MIK2代表了一种独特的模式识别受体（PRR），它具有双重角色，既能感知MAMPs（微生物相关分子模式），也能感知DAMPs（损伤相关分子模式）。然而，这种双功能PRR如何感知来自不同界别的配体的生化机制尚未阐明。

植物RKs中存在很多天冬酰胺（N）残基的糖基化（N-糖基化）现象，并且通常对其蛋白活性至关重要。先前的研究表明，N-糖基化缺陷可能会损害蛋白质成熟、质膜靶向和构象维持。探索植物 RKs 的 N-糖基化的新角色可以大大推进对配体诱导的RK激活和信号传导机制的理解。

研究内容

一、在十字花科植物中MIK2–BAK1复合体感知SCOOP

研究表明不同十字花科植物中的MIK2同源物与拟南芥的MIK2（AtMIK2）相比，氨基酸相似性高于80%。另外，植物中SCOOPs仅存在于十字花科家族中，而研究最多的是拟南芥中的AtSCOOP12。本研究利用GST-pull down技术，证明了AtSCOOP12 和 FocSCOOPL可以诱导AtMIK2 和 AtBAK1胞外域复合体的形成（图1a），这与之前研究结果相一致。类似的，BnSCOOP则能诱导BnMIK2^ECD和BnBAK1^ECD异二聚化（图1b）。同时BnSCOOP也能在拟南芥原生质体中诱导AtMIK2依赖的MAPK激活（图1c）。此外，与AtMIK2类似，BnMIK2在拟南芥突变体mik2-1原生质体中弥补了由AtSCOOP12或BnSCOOP触发的MAPK激活（图1d）。

图1 SCOOP诱导拟南芥和甘蓝型油菜的MIK2-BAK1相互作用

二、MIK2形成与SCOOPs复合的超螺旋构象，并通过氢键识别多种SCOOPs

为了在原子层面上理解MIK2识别SCOOP的机制，研究人员结晶出了MIK2^ECD-SCOOPs二元复合物。并确定了AtMIK2^ECD-3M-AtSCOOP12复合物以及BnMIK2^ECD与FocSCOOPL复合物的晶体结构。随后通过序列比对、GST-pull down、结构分析以及MAPK激活等实验，证明AtMIK2^ECD-3M的功能与野生型相同，其晶体结构可以代表野生型的构象（图2a）。同时也发现AtMIK2^ECD-3M-AtSCOOP12和BnMIK2^ECD–FocSCOOPL复合物的结构几乎相同。MIK2^ECD采用超螺旋构象（图2a），这与其他LRR-RKs的ECDs类似，并且其C末端具有高度的构象灵活性，可能对于MIK2ECD结合不是必需的（图2a,b）。

SCOOPs与MIK2^ECD的N-末端凹面一侧从LRR3开始结合（图2a）。具体来说，AtSCOOP12中的S5侧链羟基由AtMIK2^ECD中的D246稳定（图2b）。同时，在AtMIK2^ECD-3M-AtSCOOP12复合结构中，AtSCOOP12的S7侧链羟基与AtMIK2^ECD的S292和H316形成氢键。所以，为了确认AtSCOOP12与AtMIK2结合的关键位点，研究人员创制了AtMIK2 D246A、S292A、H316A和S292A/H316A突变体。随后的GST-pull down实验中除了S292A，其他突变体均减弱了AtSCOOP12与AtMIK2的结合（图2c）。另外，AtMIK2D246A和S292A/H316A突变体与野生型相比，在参与AtSCOOP12诱导MAPK激活方面显著降低（图2d）。这些结果表明，D246和H316对于AtMIK2发挥功能至关重要。有意思的是，与其他LRR-RKs（AtFLS2、AtPEPR1）不同，AtMIK2^ECD/BnMIK2^ECD主要通过氢键相互作用识别SCOOPs的骨架。

图2 MIK2^ECD-SCOOPs二元复合体的结构以及MIK2^ECD对SCOOPs的特异性识别

三、MIK2^ECD-SCOOPs-BAK1^ECD三元复合物的结构，以及SCOOPs的11-13氨基酸残基介导MIK2-BAK1相互作用

为了探究SCOOP诱导的MIK2^ECD与BAK1^ECD异聚体化的结构基础，研究人员解析了AtMIK2^ECD-3M-AtSCOOP12-AtBAK1^ECD的三元复合物的晶体结构（图3a）。AtBAK1^ECD锚定在AtMIK2^ECD的C末端（LRRs 17-23）上，而SCOOP横跨AtMIK2^ECD的LRRs 3-14的凹面，其C末端连接AtBAK1^ECD与AtMIK2^ECD。并且，AtBAK1^ECD的结合不会引起AtMIK2^ECD构象的显著变化。相比之下，SCOOPs构象则显示出很大的差异，其中几个位于C末端的残基在未结合AtBAK1^ECD时由于灵活性而看不到，而在结合AtBAK1^ECD后就可以观察到。这表明SCOOPs的C末端部分在促进AtMIK2^ECD-AtBAK1^ECD异二聚化中起着关键作用。随后利用AtSCOOP12的不同突变体进行蛋白互作分析、植物免疫响应以及植物幼苗根长检测等试验，揭示了AtSCOOP12/FocSCOOPL G11 to R13在促进AtMIK2-AtBAK1异二聚化中的重要作用，并证明了AtSCOOP12/FocSCOOPL的C末端任何延伸都会损害其活性（图3）。

图3 MIK2^ECD-SCOOP-BAK1^ECD三元复合物的结构以及SCOOP介导的MIK2^ECD与BAK1^ECD之间的相互作用

四、MIK2上的（天冬酰胺）N-糖基化介导其与BAK1的相互作用

在植物RKs中发现的N-糖基化在蛋白质成熟、质膜靶向以及蛋白质构象维持中起着至关重要的作用。由于MIK2^ECD中存在多个保守的N-糖基化N-X-S/T基序，我们推测MIK2也会经历N-糖基化过程。事实也确实如此，在对MIK2^ECD-SCOOPs二元复合物和MIK2^ECD-SCOOPs-BAK1^ECD三元复合物的晶体结构研究中，N-糖基化是共价连接到AtMIK2^ECD和BnMIK2^ECD中几个保守的天冬酰胺残基上的。值得注意的是，质谱分析和结构分析共同揭示了N-糖基化的AtMIK2^ECD N410/BnMIK2^ECD N393位于LRR14的内表面以及之前所述SCOOP C-末端结合通道内（图5a），这暗示了该位点的N-糖基化可能与SCOOP诱导的MIK2^ECD–BAK1^ECD异二聚体化有关，因此对于诱导植物免疫反应非常重要。

为了探究AtMIK2^ECD N410/BnMIK2^ECD N393位点的N-糖基化的确切功能，研究人员创建了一系列在此位点无法进行N-糖基化的突变体，包括AtMIK2^ECD N410A/D和BnMIK2^ECD N393A/D。并且表明这些突变体与野生型几乎具有相同的蛋白构象，说明在AtMIK2^ECD N410/BnMIK2^ECD N393位点的N-糖基化对于天然蛋白构象是非必要的。随后研究表明，在AtMIK2^ECD存在下，N410附着的N-糖链使得三元复合物保持稳定，并在100纳秒（ns）后显示出很少的构象变化（图5d，左图）。此外，不能与AtMIK2^ECD N410位点的N-糖基化形成氢键的AtBAK1^ECD D50A/T52V突变体，在GST pull down实验中，经SCOOP处理后无法与AtMIK2^ECD相互作用。以上结果表明，AtMIK2^ECD N410/BnMIK2^ECD N393的N-糖基化介导了AtMIK2^ECD-AtBAK1^ECD相互作用，这对于MIK2^ECD-SCOOPs-BAK1^ECD三元复合物的形成和稳定是必不可少的。

通过结构和生化分析以及生物信息学数据的相互印证，与野生型AtMIK2不同，AtMIK2 N410D突变体无法在mik2-1原生质体中恢复AtSCOOP12诱导的MAPK激活（图5e）。与野生型AtMIK2相比，N410D突变体在N. benthamiana叶片中显著减弱了AtSCOOP12诱导的ROS产生。此外，研究表明N410位点的N-糖基化对于AtMIK2的亚细胞定位是非必需的。并且也证明AtMIK2 N410位点的N-糖基化对其蛋白质质量控制没有影响（图5f）。

以上数据表明，AtMIK2 N410/BnMIK2 N393位点的N-糖基化在加强SCOOP诱导的MIK2^ECD-BAK1^ECD异二聚体形成过程中，对SCOOPs的感知起着关键作用。

图4 N-糖基化介导MIK2^ECD和BAK1^ECD之间的相互作用

总结

蛋白质中的N-糖基化是一种普遍存在的共翻译和后翻译修饰过程。在拟南芥受体激酶FLS2和EF-TU受体（EFR）的研究中，发现N-糖基化的缺乏会损害它们的蛋白质折叠、质量控制以及后续运输等过程，导致植物免疫功能障碍。在本研究中，作者展示了受体类激酶MIK2的胞外域也受到多个位点的N-糖基化。并且发现附着在MIK2上的N-糖基可以借助与BAK1的直接相互作用，加强由SCOOP诱导的MIK2-BAK1异二聚化。结合突变和遗传分析，作者提出了一种新的机制，其中SCOOP诱导的MIK2-BAK1复合体的激活可能是通过蛋白质N-糖基化介导的。