来源于簇毛麦的广谱抗白粉病基因Pm21
1.小麦-簇毛麦6V附加系及代换系的创制
Sears (1953)首次展示了从簇毛麦 (Haynaldia villosa (L.) Schur,同义名：Dasypyrum villosum(L.) Candargy，2n = 14，VV)向普通小麦进行基因转移的可行性。20世纪80年代初，簇毛麦被鉴定为白粉病抗性的重要潜在来源，南京农业大学农学院细胞遗传研究所的研究人员们开始致力于将这种抗性转移到小麦中，在1986年和1988年分别开发了小麦-簇毛麦的6V附加系和6V代换系，以丰富抗白粉病基因库(Chen et al. 1995)。
2.小麦-簇毛麦6VS整臂易位系的创制及Pm21的命名
然而，由于6V与小麦同源染色体之间缺乏同源性，直接将该基因用于小麦育种受到了阻碍。因此，Chen et al. (1995)尝试通过对小麦-簇毛麦6V代换系与普通小麦扬麦5号（当时广泛种植于长江中下游麦区，但易感白粉）的杂交后代进行辐射诱导和筛选，以产生抗病的6VS/6AL易位系。其中的五个易位系（92R089,92R137, 92R141, 92R149和92R178），被分发给国内外50多个小麦研究机构或大学，至今已被广泛用于小麦育种。定位于6VS染色体臂上的基因，被命名为Pm21。
3.小麦-簇毛麦6VS缺失系、小片段易位系的创制及Pm21初步的物理定位
Qi et al. (1998)和Chen et al. (2008)分别通过抗病缺失系del6VS-1（FL 0.58）和感病缺失系del6VS-2（FL 0.45）的构建，Pm21进一步定位于6VS染色体0.45-0.58区段。随后，Cao et al. (2011)通过整合分子和细胞遗传学技术，在6VS染色体0.45-0.58区段克隆并表征了一个推测的丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶基因Stpk-V。单细胞瞬时表达分析、转基因、BSMV及RT-PCR的结果表明，Stpk-V赋予对白粉病的高度抗性。接着，Chen et al. (2013)利用电离辐射创制了一系列携带白粉病抗性的6VS小片段的纯合易位系，通过GISH、分子标记及Bgt接种实验，鉴定了NAU418（染色体末端异位）和 NAU419（染色体中间异位）的材料。
4.通过细胞遗传学材料的开发、诱变、抗性基因富集与测序（RenSeq）-PacBio长片段组装及功能分析等综合手段克隆Pm21
RenSeq方法为从整个基因组中快速克隆全长NLR基因提供了方法。Xing et al. (2018)利用小片段易位系NAU427及两个回交群体，将Pm21位点缩小到一个较小的物理区域并提供了精确定位候选基因的有效材料。随后，作者通过簇毛麦基因组数据的RenSeq-PacBio结果、共线性分析及表达NLR的RNA测序，发现只有2个NLR位于NAU427的6VS片段上。为了鉴定Pm21的候选基因，作者从EMS处理的T6VS·6AL种子中筛选出8个对白粉病感病的突变体（SM-1至SM-8），通过测序比较T6VS·6AL与突变体中的NLR1-V和NLR2-V的序列，发现所有突变体中NLR1-V编码序列均有非同义突变，而NLR2-V则与野生型T6VS·6AL中的序列相同。单细胞瞬时过表达和Bgt侵染分析用于测试NLR1-V在小麦叶表皮细胞中的功能。接着，作者利用VIGS（因CC结构域高度保守，故只沉默了NBS和LRR结构域）及转基因实验，验证了NLR1-V的功能。在Bgt感染过程中，NLR1-V在抗性T6VS·6AL的幼苗中的表达迅速诱导。为了来验证NLR1-V的天然启动子是否对Bgt侵染有响应，作者将NLR1-V的天然启动子克隆并与GUS基因融合，发现该启动子与抗病反应密切相关。通过25个与Pm21基因共分离的新标记，作者从2.58 Mb的区域中提取了包含19个ORFs的区域，其中部分基因可能在抗病中发挥了关键作用。最后，微共线性分析表明，Pm21位点在分析的禾本科植物中基因顺序相对保守，而NLR1-V及其直系同源基因在不同物种间的多样性高于其两侧基因及其相应的直系同源基因。结构变化伴随插入导致NLR1-V直系同源基因在普通小麦亚基因组中的破坏，揭示了这些基因在不同物种中的多样性以及基因结构的变化如何影响抗病性。
5.基于不同物种间基因组共线性在簇毛麦中定位并克隆Pm21
由于6VS和小麦同源染色体之间缺乏重组，在小麦背景下使用传统的基于图位克隆的策略并不适用于Pm21的分离。短柄草Brachypodium distachyon基因组是开发特异性标记和比较定位小麦及其野生近缘种功能基因的有用工具。基于短柄草与禾本科物种之间的基因组共线性，江苏大学何华纲课题组Bie et al. (2015)开发出了MBH1，作为Pm21分子标记辅助选择（MAS）的高效标记。
随后，He et al. (2016, 2017)幸运地从簇毛麦的自然群体中鉴定出4个苗期感病的簇毛麦系（DvSus-1至DvSus-4），基于短柄草、水稻(Oryza)和山羊草或其他小麦族植物(Triticeae)基因组的共线性，开发了一组25个基因衍生标记，用于揭示携带Pm21的DvRes-1与DvSus-1之间的多态性。使用由DvSus-1与DvRes-1杂交衍生的极大规模的F2分离群体，构建了Pm21的精细遗传图谱。随后，Pm21被定位在由标记6VS-08.4b和6VS-10b定义的0.01 cM的遗传区间中。此外，基于使用EMS处理扬麦18诱导的感病缺失系Y18-S6，Pm21被定位到相似的物理区间中。比较分析显示，Pm21所在区间的同源区域在短柄草中被缩小到一个包含18个基因的112.5 kb基因组区段。此外，发现Pm21与一个抗病基因类似物（RGA）标记共分离。该RGA位点的成员编码典型的CC-NBS-LRR蛋白。
随后，He et al. (2018)从抗病簇毛麦系DvRes-1 中扩增并测序了RGA标记及其周围的基因组序列。随后组装了一个含有三个基因（DvPP2C、DvRGA2 和 DvRGA1）的基因组序列，以及一个包含DvRGA3的分离片段。遗传分析表明，这三个RGA基因在由抗Bgt系（DvRes-1）与感病系（DvSus-1）杂交产生的F2 群体中与Pm21共分离。其中，DvRGA1和DvRGA2都可以通过翻译产生典型的CC-NBS-LRR蛋白，而DvRGA3编码LRR结构域的序列因几个过早终止密码子的存在而中断，表明它是一个假基因。定量RT-PCR（qPCR）显示，在接种Bgt的Pm21携带品种扬麦18中，DvRGA1和DvRGA2的表达模式相似，但DvRGA2的转录水平高于DvRGA1。作者通过VIGS沉默DvRGA2而非DvRGA1使得Bgt菌落在叶片上大量发育，并伴随白粉病和真菌孢子形成。
接着，作者在扬麦18中进行了EMS诱变的M2家系中，鉴定出独立的感病突变体，发现均含有DvRGA2序列的突变。其中，绝大部分存在单碱基突变，个别有两个碱基的变化，引起了氨基酸的变化和过早终止密码子。此外，作者随机选取了部分感病突变体，未发现侧翼基因DvPP2C和DvRGA1突变。Southern杂交分析也表明DvRGA2是簇毛麦中的单拷贝基因。接着，作者将携带原生启动子的DvRGA2转入感病品种科农199，得到6个转基因阳性植株。定量RT-PCR分析表明，DvRGA2在这6个转基因系中均有表达。从这些系中产生的T2植株对白粉病的其他17个纯化小种和从中国不同地区（北京顺义等地）收集的15个小种的混合菌均表现出免疫性。因此，DvRGA2是Pm21，可以在转基因小麦中可以赋予广谱白粉病抗性。
为了寻找了Pm21的同源基因，作者发现普通小麦、乌拉尔图小麦、拟斯卑尔脱山羊草和节节麦中的第二个内含子中均被类逆转座子元素破坏，表明结构变异发生在簇毛麦与这些物种分化之后。因此，Pm21可能是禾本科植物中相对较为古老的Pm基因，但它在普通小麦及其近缘物种中的同源物已成为假基因。为了研究Pm21等位基因的多样性，从63个抗白粉病的簇毛麦种质中获得了包括Pm21在内的72个序列。其中，38个非冗余等位基因被用于进一步研究。这些等位基因的编码序列具有91.7%–100%的同一性，推测的氨基酸序列具有86.5%–100%的同一性。作者确定了全长蛋白质、不同结构域和非结构域的非同义（Ka）和同义（Ks）核苷酸替换率。仅在预测的溶剂暴露LRR残基上观察到相对较高的Ka/Ks比率（4.02），表明这些残基发生了多样化选择。
最后，作者发现DvRGA2和NLR1-V编码相同的蛋白质，但在第二个内含子中存在少量插入缺失多态性。因此，DvRGA2和NLR1-V可能是等位基因。
References
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