Nature Communications|高大山羊草的一种含整合CC-BED模块的NLR蛋白Pm6Sl介导了对小麦白粉病的抗性
文摘
2024-09-28 20:00
陕西
小麦白粉病由小麦白粉菌（Blumeria graminis f. sp. tritici，Bgt）引起，对全球粮食安全构成了重大威胁，鉴定并应用有效的抗病基因被认为是减少小麦白粉病影响的最经济、有效且环保的方法。小麦的野生近缘种包含多种多样的抗病基因，通过导入小麦野生近缘种的染色体片段来增加抗病基因的遗传多样性，是一种广泛采用的策略。高大山羊草（Aegilops longissima Schw. et Musch.，2n = 2x = 14，SlSl）是山羊草属二倍体S基因组物种，属于小麦族，是抗秆锈病、白粉病、颖枯病、眼斑病和抗旱性等的宝贵遗传多样性资源。这些抗性基因中，Pm13位于3Sl染色体上，Pm66位于4Sl染色体上，均已成功导入小麦。作者之前发现了一个名为Pm6Sl的抗白粉病基因，位于高大山羊草6Sl#3染色体上，并通过ph1b基因诱导的同源重组将其转移至小麦中。通过分析携带Pm6Sl的小麦-高大山羊草二体添加系TA7548与中国春ph1b缺失突变体系TA3809进行杂交产生的F2群体，作者将Pm6Sl定位在6Sl#3的长臂上，位于标记Ael58410和Ael57699之间的42.80 Mb区域内。![]()
2024年9月27日，河南农业大学生命科学学院刘文轩课题组联合中国科学院遗传发育研究所赵玉胜课题组，在Nature Communications期刊发表了题为“An Aegilops longissimi NLR protein with integrated CC-BED module mediates resistance to wheat powdery mildew”的文章。在这项研究中，作者从高大山羊草中克隆了抗白粉病基因Pm6Sl。该基因编码一种核苷酸结合的富含亮氨酸重复序列（NLR）蛋白，其特点是包含一个由锌指BED（Znf-BED）结构域整合到卷曲螺旋（CC）结构域中的CC-BED模块, 被命名为Znf-BED CNL。通过EMS诱变、基因沉默（VIGS）和转基因实验验证了Pm6Sl的功能。此外，作者还创制出一种携带Pm6Sl的抗病种质，其基因位于一个非常小的外缘染色体片段中且没有连锁累赘，并且开发了基因标记pm6sl-1，以便于将Pm6Sl应用于小麦育种项目中。Pm6Sl作为一种具有BED-NLR结构的抗病基因的克隆，将有助于进一步理解BED-NLR介导的抗病机制。Pm6Sl 被精确定位在 6Sl#3 长臂的 210 kb 区间内为了精确定位Pm6Sl，作者通过自交之前开发的在ph1b纯合背景中的杂合Pm6Sl重组植株，产生了一个次级Pm6Sl分离群体（F3）。首先，作者从高大山羊草品种TL05的参考基因组中提取了Ael58410和Ael57699的对应基因组序列（图1a）。然后，作者优先选择了低拷贝数区域，并开发了20个6Sl#3特异性PCR标记。接下来，作者筛选了8000个F3个体，发现了105个缺失Ael58410或Ael57699的重组体。通过对这105个重组体使用20个新开发的标记进行基因分型，并结合其对白粉病菌（Bgt）分离株E26的表型反应，作者将Pm6Sl定位在Ael03991（654.11 Mb）和Ael04335（655.04 Mb）之间的0.93 Mb区间内（图1b）。接下来，作者在0.93 Mb区域内开发了五个额外的标记，并从含有Pm6Sl杂合重组体T27-VI和T3012的800株F4植株中，筛选出了两种不同类型（U型和V型）的八个6Sl#3重组体（图1c）。这八个重组体都对白粉病菌E26表现出抗性。通过整合这八个重组体对白粉病菌的反应，并使用五个标记进行分析，作者进一步将Pm6Sl精确定位在Ael39960和Ael09126之间的210 kb区域内（654.21-654.42 Mb）（图1c）。对该210 kb区域的注释显示其中有七个基因，其中只有TL05.6S01G0714700（命名为CNL1）和TL05.6S01G0715000（CNL2）被注释为编码抗病蛋白（R蛋白），而其余五个基因被预测为编码未知功能的蛋白（图1d）。![]()
诱变和基因沉默实验表明 CNL1 是 Pm6Sl 的最佳候选基因使用引物 SALF-CNL1 和 SALF-CNL2，作者分别从 Pm6Sl 供体TA7548中通过基因组DNA（gDNA）或cDNA扩增CNL1和CNL2序列。通过Sanger测序对扩增子进行测序，并比较gDNA和cDNA序列，结果显示来自TA7548的CNL1的gDNA序列长度为4496个碱基，包含三个外显子，编码一个由1431个氨基酸组成的蛋白质。对于CNL2，TA7548的gDNA序列长度为3262个碱基，转录后编码2979个碱基的编码序列（CDS），并包含三个外显子，编码一个由992个氨基酸组成的蛋白质。此外，CNL1和CNL2序列在中国春小麦中缺失。因此，CNL1和CNL2基因被优先作为Pm6Sl的候选基因。为了确定导致Pm6Sl功能的关键基因，作者通过分析30个来自EMS处理的TA7548S的独立易感突变体，来识别潜在的Pm6Sl候选基因。对这30个易感突变体的CNL1变异分析显示，29个突变体中的CNL1基因存在引入提前终止密码子或导致非同义氨基酸改变的突变，而仅有两个突变体（Mut12和Mut24）表现出CNL2的突变，但它们也在CNL1中携带了非同义突变（图2a）。此外，作者使用BSMV-VIGS对TA7548中的CNL1或CNL2进行基因沉默，以验证它们的功能。结果显示，使用BSMV:γCNL1构建体沉默CNL1导致TA7548植株对白粉病的易感性增加（图2b），而使用BSMV:γCNL2构建体沉默CNL2并未改变植株的抗性水平（图2b）。这些结果证实了CNL1而非CNL2是Pm6Sl的最有前景的候选基因。![]()
图 2 | 通过EMS诱导突变体和VIGS验证Pm6Sl候选基因转基因实验验证了候选基因 CNL1 为 Pm6Sl为了确认CNL1是否负责含有Pm6Sl的植物的抗白粉病能力，将受玉米Ubi启动子驱动的CNL1编码序列（CDS）引入了易感白粉病的小麦品种Fielder中。共生成了24株T0植株，其中20株为CNL1阳性，4株为阴性。这些植株自交并培育到T1代（图3a）。在20株阳性T1系中，L17和L21的CNL1表达水平与携带小型6Sl片段并携带Pm6Sl的抗病重组体T3012II-3相当，而其他18株T1系的CNL1表达水平显著较高（图3b）。对这20株T1系的抗性评估显示，所有CNL1阳性转基因植株均对白粉病菌（Bgt）分离株E26表现出抗性，而CNL1阴性植株则表现为易感性（图3a）。此外，CNL1阳性T1植株在抽穗期继续对白粉病表现出抗性，表明Pm6Sl能够赋予全生育期抗性（图3c）。通过使用CNL1的原生启动子和基因组序列进行的转基因实验进一步验证了CNL1的功能，将其引入Fielder小麦中，并生成了六株独立的转基因T0幼苗。所有植株均为CNL1阳性，并表现出与抗病对照T3012II-3类似的抗白粉病能力。这些结果表明，正常和较高的CNL1表达均能有效赋予对Bgt分离株E26的抗性。综上所述，突变、VIGS诱导的基因沉默和转基因实验的一致结果确认了CNL1即为Pm6Sl基因。![]()
图 3 | Pm6Sl 候选基因 CNL1 的转基因实验Pm6Sl 编码含有 CC-BED 模块的 NLR 蛋白为了研究Pm6Sl蛋白的结构特征，作者使用了AlphaFold2人工智能增强系统生成了一个三维模型。结果显示，Pm6Sl编码的NLR蛋白不仅包含预期的N端CC结构域，还包含一个Znf-BED结构域、一个中央的NB-ARC位点和一个C端的LRR区域（图4a）。Pm6Sl的CC结构域由四个α螺旋（α1–4）组成，与常规CNL蛋白的结构相似；然而，Znf-BED结构域整合在其α3和α4螺旋之间，形成了一个α1-3-BED-α4嵌合结构，作者将其命名为“CC-BED模块”（图4b）。此外，将易感突变体中的氨基酸变化纳入Pm6Sl的三维模型后，发现所有四个结构域都有导致氨基酸变化的突变：CC-BED模块中有两个突变，NB-ARC结构域中有11个突变，而LRR结构域中有18个突变。由于Pm6Sl所有结构域的突变导致抗性的丧失，表明这些结构域在Pm6Sl介导对小麦白粉病的抗性中都是必不可少的。![]()
为了探索Pm6Sl如何提供对病原物的抗性，作者将T3012II-3和中国春（CS）幼苗感染Bgt分离株E26，并使用台盼蓝（TPN）染色进行观察。与CS幼苗相比，T3012II-3幼苗中观察到了更深的染色，表明细胞死亡增加。此外，二氨基联苯胺（DAB）染色实验表明，T3012II-3感染的细胞内积累了显著更高且更稳定水平的细胞内活性氧（intraROS），相比之下，CS感染的细胞中活性氧水平较低（图4d）。这些结果表明，Pm6Sl可能通过促进细胞死亡来介导对白粉病的抗性。此前的研究表明，宿主细胞死亡响应效应子触发的免疫反应由NLR蛋白的CC结构域控制。为了阐明Pm6Sl触发细胞死亡的机制，作者在烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中进行了一项瞬时表达实验。结果表明，只有CC-BED模块触发了细胞死亡，而完整的Pm6Sl蛋白及其他截短的Pm6Sl N端蛋白（包括α1-3、α1-3-BED、α1-4（CC）蛋白或Znf-BED）均未表现出这种能力（图5a）。此外，两种突变的CC-BED模块（CC-BEDL21F和CC-BEDM172I），它们将TA7548S从抗白粉病变为易感性，仍然保留了在烟草中诱导细胞死亡的能力（图5b）。这些发现表明，CC-BED模块的完整性对于诱导细胞死亡至关重要，至少在所测试的条件下是如此。作者还进行了结构预测分析，以确定在六种其他已知的抗性BED-NLR蛋白中是否存在N端CC-BED模块，这些蛋白包括来自小麦的Yr5/Yr7/YrSP、来自水稻的Xa1/Xo1以及来自大麦的Rph15。结果显示，这些BED-NLR蛋白的N端也存在一个CC-BED模块，其结构与Pm6Sl相似。然而，在烟草叶细胞中瞬时表达这些六种BED-NLR蛋白的CC-BED、CC（α1-4）和Znf-BED时，发现与Pm6Sl不同，这些截短蛋白在所测试的条件下均未诱导细胞死亡（图5c）。因此，研究提出CC-BED模块可能代表一种保守的结构，在BED-NLR介导的抗性中可能有不同的功能。![]()
图 5 | 不同BED-NLR蛋白CC-BED模块在烟草叶片中的致死能力分析为了探究Pm6Sl的进化起源，作者首先在国家生物技术信息中心（NCBI）的非冗余蛋白序列数据库中搜索了Pm6Sl的同源蛋白。结果表明，获得的蛋白序列与Pm6Sl的序列相似度较低（同一性低于75%）。随后对已发表的基因组序列进行了比较分析，结果显示在与小麦相关的物种的同源第6组染色体上缺乏Pm6Sl的直系同源基因。因此，推测Pm6Sl可能仅存在于高大山羊草中，尽管这一假设还需要进一步研究来证实。为了探讨Pm6Sl与其他已知NLR蛋白的关系，作者使用Pm6Sl和其他六种已克隆的BED-NLR蛋白以及禾本科家族中已知的174种NLR蛋白进行了系统发育分析。结果表明，Pm6Sl与大麦的Rph15关系最为密切。然而，序列比对分析显示，Rph15与Pm6Sl之间的氨基酸序列同一性非常低（48.8%）。进一步的Znf-BED结构域的系统发育树分析表明，Pm6Sl与其他六种已克隆的BED-NLR蛋白的Znf-BED结构域有所不同，而后者在与小麦相关物种的同源第6组染色体中编码的蛋白中高度保守。相反，Pm6Sl的Znf-BED结构域与这六种抗性BED-NLR蛋白的Znf-BED结构域之间的同一性为38-45%。因此，推测Pm6Sl的Znf-BED结构域的整合可能独立于这六种已表征的BED-NLR蛋白。在Pm6Sl基因克隆过程中，创制了多个含有Pm6Sl的小麦-高大山羊草（CS-Ae. longissima）重组系，其中T3012II-3携带了一个长约0.21 Mb的片段，该片段含有Pm6Sl，相当于高大山羊草（品种TL05）6Sl染色体（666.21 Mb）的约0.03%。T3012II-3的农艺性状与中国春相比没有显著差异，表明在T3012II-3植株中Pm6Sl没有引起不利的连锁累赘（图6a, b）。同时，设计了一个针对Pm6Sl的特异性基因标记pm6sl-1（图6c）。使用该标记对112个小麦品种或育种系进行了评估，并以Pm6Sl种质系作为对照，结果显示没有发现携带Pm6Sl位点的植株，表明其作为Pm6Sl诊断性基因标记在育种中的实用性。为了进一步探讨Pm6Sl在小麦育种中的价值，作者使用从中国主要小麦种植省份收集的36个具有不同毒力谱的Bgt分离株进行了抗性谱实验。结果显示，携带Pm6Sl的T3012II-3在苗期对其中35个Bgt分离株表现出免疫或抗性（感染等级为0–2）。这些发现证实了Pm6Sl赋予了对多种Bgt分离株的抗性。此外，如前所述，Pm6Sl能够赋予全生育期抗性，从而进一步强调了其在小麦育种中应用的巨大潜力。![]()
图 6 | T3012II-3 的农艺性状研究及基因标记 pm6sl-1 的开发作者通过利用ph1b诱导的同源重组和定位克隆，从高大山羊草中分离出了Pm6Sl，并将其整合到了普通小麦背景中，结合了通过诱变、基因沉默和转基因实验对基因功能的验证。Pm6Sl编码了一种含有CC-BED模块的NLR结构，其在赋予作物抗多种病原体的BED-NLR蛋白中具有结构保守性。此外，作者还创制了多种含有短Pm6Sl片段且无不良农艺性状的小麦-高大山羊草重组系，并开发了基因标记pm6sl-1，以促进Pm6Sl在小麦育种中的应用。
