玉米是非常重要的农作物，其机械化收获是解决劳动力成本不断增加，提高生产效率的有效途径。但是由于玉米在收获时含水量的原因，导致大部分国家都没有实现机械化收获。籽粒脱水率（KDR）是收获时水分含量的关键决定因素，收获时过高的含水量严重影响收获效率且增加干燥成本。因此提高KDR，降低含水量也成为现代玉米的育种目标。
2024年11月12日，华中农业大学严建兵团队在Cell上发表一篇题为“A Zea genus-specific micropeptide controls kernel dehydration in maize”的论文，鉴定到一个影响玉米脱水率（KDR）的小肽microRPG1，其通过调控乙烯信号通路基因的表达来控制KDR。这为未来作物育种提供参考。
1、定位qKDR1
在K22 和DAN340杂交构成重组自交系中，定位到4个关于KRD的QTL,其中位于1号染色体长臂上的qKDR1有最大表型变异，所以选择qKDR1为克隆对象。鉴定qKDR1的近等基因系NILDAN340和 NILK22（1A,B）发现NILK22的脱水速率更快，收获时含水量降低，其他农艺性状无明显差异。根据玉米参考基因组，qKDR1进一步被缩小到1417bp范围内，在该区域内，NILDAN340有6181bp的插入片段（1C）。通过对玉米自交系（Zheng58 similar to NILK22，B104 similar to NILDAN340）的目标区域进行CRISPR-Cas9（1D），发现与野生型相比，敲除系的KDR变慢（1E,F），验证了qKDR1功能。另外，在该区段中，除6181bp的插入还发现另外2个缺失插入的自然变异，进而将该区域分为5种单倍型（1G），其中4种单倍型有较低的KDR（1H）。这些结果都表明， 1417 bp是qKDR1导致KDR变异的关键序列。
2、qKDR1 为沉默因子
通过在玉米原生质体中进行瞬时转录活性测定（2A,B）。发现与对照相比，pUbi2D和pUbi2K的活性降低，pUbi2K的GUS活性低于pUbi2D，说明qKDR1的存在降低GUS的表达，且qKDR12K的抑制作用大于qKDR12D（2C）。表明不同的qKDR1等位基因可以抑制靶基因的表达。然后又选择不同大小片段进行实验（2A,B），发现都表现出与pUbi2K相似的抑制活性（2C）。这些结果表明，qKDR1的369 bp序列是核心序列，NILDAN340的6181 bp插入降低沉默活性。
3、RPG是qKDR1的靶基因
通过对不同qKDR1基因型的4个NILs进行RNA-seq（2D）选择差异表达的基因可作为候选靶基因。有17个基因，3个上调，14个下调（2E,F）。其中只有RPG基因位于qKDR1上游10kb处，与qKDR1最近（1C）。与KDR表型一致，在玉米籽粒中高表达。qPCRs显示在玉米籽粒成熟后期，NILK22中RPG的表达量低于NILDAN340（2G）。RPG在上述敲除系也是高表达（2I）。为进一步证明RPG受qKDR1调控，进行LUC实验，结果与GUS活性的瞬时转录活性实验结果一致，进一步表明，qKDR1是RPG表达的抑制因子，并且qKDR1的369 bp区域足以沉默活性。
根据ChIPseq数据显示有43个转录因子可以结合到qKDR1区域，且其中两个恰好被注释为转录抑制因子（ZmMYBST1， ZmMYBR43)。通过mRNA原位杂交，证实ZmMYBST1、ZmMYBR43和RPG的表达模式相似，都在胚芽、糊粉层和placento-chalazal区表达。再次通过进行瞬时转录活性测定评估ZmMYBST1和ZmMYBR43对qKDR1调控RPG表达的影响，与对照组相比，与ZmMYBST1或ZmMYBR43共表达导致两个报告基因的LUC活性受到强烈抑制。此外，与野生型相比，CRISPR-Cas9产生的ZmMYBST1和ZmMYBR43双突变体显著减缓KDR。这些结果表明，ZmMYBST1和ZmMYBR43在体内靶向qKDR1区域抑制RPG的表达。
4、RPG编码一种功能性小肽
虽然RPG在玉米参考基因组中未被标注。但是RNA-seq读取映射到RPG区域，可能发生转录。因此，对cDNA末端进行过快速扩增，在NILK22中发现两个全长RPG转录本（T01和T02），长度分别为2,013和1,723 bp (3B)。接下来使用ORF finder筛选两个转录本的ORF，发现12个假定的ORF（3C），其中最大的是编码58个氨基酸的微肽。根据sRNA-seq结果显示，RPG可能不通过产生sRNA发挥作用(3D)。然而， Ribo-seq结果显示，RPG mRNA是在ORF1、ORF2和ORF3区域结合的核糖体，这表明它编码一个或多个微肽（3E）。为验证RPG是否通过编码小肽而不是lncRNA发挥作用，通过过表达全长RPG和12个ATG突变为CTG的突变型RPG表明，过表达RPG导致KDR变慢，而不能进行翻译的突变型RPG不能改变KDR。这些结果表明，RPG通过编码小肽而不是通过lncRNA发挥作用。筛查不同的玉米自交系群体，发现在RPG区域存在两个自然缺失，导致ORF2和ORF3序列缺失。通过CRISPRCas9敲除ORF2和ORF3，发现与野生型相比，这些系的KDR无明显差异。相比之下，ORF1中的三个移码突变（3F，G）都导致更快的KDR。这些发现表明ORF1是编码功能性RPG小肽。
6、microRPG1可能通过调控乙烯信号传导来控制籽粒脱水
为了解microRPG1是如何起作用的，对microRPG1敲除系和过表达系进行RAN-seq，并与野生型和经microRPG1处理的拟南芥比较。发现384个基因在microRPG1敲除系中显著下调，在过表达系中显著上调（5A,B）。由于RPG在玉米籽粒发育后期高表达，说明microRPG1可能只在特定的发育时期起作用，通过Z评分筛选与RPG表达模式相似的差异表达基因。发现11个基因在种子、胚乳和胚芽中具有与RPG相似的表达模式（图5C），可能受到microRPG1的调控，在玉米籽粒发育后期发挥类似的作用。其中，拟南芥和水稻中乙烯传导中的关键成分EIN3/EIL1的同源基因Zm00001d047563的表达量最高（5C，D）。玉米中4个Zm00001d047563的同源基因中，籽粒中只表达Zm00001d047563（命名为ZmEIL1）和Zm00001d028974（命名为ZmEIL3），且表达模式与RPG相似。qPCR的结果表明，ZmEIL1和ZmEIL3在microRPG1敲除系中上调，在microRPG1过表达株中下调（5E，5F）。这表明，在玉米籽粒发育后期，microRPG1的表达抑制乙烯信号，导致脱水较慢。同样的结果在拟南芥中也得到证实。利用CRISPR-Cas9技术敲除ZmEIL1和ZmEIL3，发现与野生型相比，敲除系都显著减缓KDR（5I，J），此外，还发现敲除EIL基因会显著影响对种子发芽，但对籽粒品质影响较小。此外，在不同的玉米品系中施用外源乙烯时，都可以加速KDR。另外，当microRPG1过度表达或外源应用时，乙烯的5个标记基因下调，而当microRPG1被敲除时，标记基因上调，进一步支持microRPG1调节乙烯信号传导观点。
7、microRPG1微肽的起源
为研究microRPG1小肽的来源，分析其在禾本科植物中的同源区。发现仅在玉米属和蓟马属中发现同源序列，其他禾本科成员中却没有。序列比对表明，96bp的microRPG1序列在所有玉米和teosinte基因组中高度保守。虽然类似的序列存在Tripsacum dactyloides中，但它缺少一个起始密码子，没有被翻译。系统发育分析表明，一个核苷酸（ACG到ATG）突变导致ORF1小肽的进化。上述数据结合数据库中不存在已知肽关联的发现，表明microRPG1小肽应该是在65万年前 Zea和Tripsacum分化后，从一个非编码序列中重新产生的。
8、microRPG1在拟南芥中的功能
为验证microRPG1在远亲植物物种中是否发挥类似的作用。作者使用外源合成ORF1p作用于拟南芥，浓度从0.01到2 mM不等。发现在1和2 mM的肽浓度下，角果成熟延迟。接着选择2 mM浓度的ORF1p进行进一步研究，发现与对照相比（对照肽具有相同的氨基酸组成，但序列混乱），角果成熟再次延迟（7A-E）。施用ORF1p显著提高拟南芥种子水分含量，对开花时间无显著影响(7F，G)。这一结果与microRPG1在玉米中的过表达相似，导致KDR变慢。为了证实这一结果，拟南芥产生的三个microRPG1过表达系也验证这个结果。microRPG1小肽在拟南芥物中的功能与玉米相似。
