植物根系存在大量的致病微生物，会对植物的生长发育造成严重的危害。其中，芸薹根瘤菌Plasmodiophora brassicae (Pb)引起的植物根瘤病是一种土传性病害，在世界范围内对十字花科作物产量造成重大损失。
2023年6月，中国科学院遗传与发育生物学研究所周俭民、陈宇航团队合作在Cell杂志上发表了题为“WeiTsing, a pericycle-expressed ion channel, safeguards the stele to confer clubroot resistance”的研究论文。本研究从拟南芥中鉴定到了一个广谱根茎抗性基因WeiTsing（WTS），并揭示了其介导的钙信号激活在植物根部抵御 Pb 感染的分子机制。
研究结果：
1.C6对Pb具有广谱抗性
为了鉴定根瘤菌抗性基因，研究人员使用Pb小种Dayi (PbDy)，对117份拟南芥种质进行了抗性鉴定，得到了五份(Est-1, Nyl-2, Shigu-1, Slavi-1, and Vie-0)对PbDy表型高抗的拟南芥材料（图1）。此外，Est-1对其他来自中国不同地区的16个Pb小种表现抗病。表明，Est-1对根瘤菌具有广谱抗性。
使用Est-1与感病材料Col-0杂交，对其后代进行遗传解析，研究发现Est-1的抗性受一个主效显性位点的控制，并通过F2将其定位到1号染色体一个63kb区间。对Est-1完成基因组组装后发现，Col-0材料在定位区间存在一个45kb的片段缺失，在该缺失片段中，存在9个基因（C1-C9），但无一编码NLR蛋白。值得注意的是，C6-C9基因同源，且以串联重复序列排列（图1D）。为了进一步鉴定抗病基因，研究人员创制了C1-C9基因的native启动子转基因材料，受体为Col-0。C7未得到转基因阳性植株，C6转基因植株表现为植株矮化及抽薹失败。C1-C5，C8，C9转基因植株在接种PbDy后表现感病。研究人员进一步CRISPR-Cas9创制了Est-1材料分别针对C6，C7材料的突变材料，C6突变材料c6-1，c6-2表现感病，C7突变后依旧表现抗病。因此，确定C6基因为候选根瘤菌抗性基因。此外，进一步研究表明，C6基因启动子长度对基因表达调控至关重要，3.6kb 的启动子（p3.6k）能使C6 基因正常表达，从而赋予植株强抗性（图1E-G）。
图1 C6抗性基因的鉴定
2.C6基因的表达调控
C6编码一个由148个氨基酸组成的小蛋白质，与任何已知功能的蛋白质都不同源。C7、C8和C9与C6的相似性分别为68%、33%和34%。PbDy接种可诱导 Est-1 地下组织中 C6 基因转录，而未接种或接种其他 Pb小种时，C6基因转录水平低或不被诱导（图2B）。对81份拟南芥材料中的C6全长编码区分析显示，有75份（93%）的C6全长编码区缺失或断裂。6个含有全长C6编码区的种质中，Ler表现感病，其余5份表现出抗性，而Ler存在一个V35I变异，且qRT-PCR分析显示，C6Ler转录本对PbDy接种完全无应答（图2B）。序列分析显示，C6基因启动子序列在不同种质中存在差异，Est-1 的启动子（p3.6k）能赋予PbDy 诱导性，而 Ler 的启动子（p2.9k）则不能。
图2 C6启动子对转录激活和抗性的影响
3.C6基因可在油菜中对根瘤菌表现出抗性
为了研究C6基因介导的根瘤菌抗性能否用于甘蓝型油菜，研究人员分别创制了3.6kb启动子及6kb启动子的转基因材料，受体为高感Pb的甘蓝型油菜品种ZhongShuang 11（ZS11）。p6kC6转基因系对8个Pb小种表现出抗性（图2F），p3.6kC6转基因系对PbDy和PbXm小种表现抗病，并且这些转基因系生长发育均不受影响。
4.C6基因在中柱鞘中特异性表达，阻止Pb的定殖
为了进一步验证C6基因的时空表达模式，作者通过在C6基因下游插入报告基因（NLS-3xmVENUS），创制p3.6k::NLS - 3xmVENUS 转基因植株，对接种根瘤菌的植物根茎地下组织进行PI染色。由于植物根茎凯氏带的存在，PI染料无法对内皮层细胞和中柱鞘细胞进行着色，而报告基因的表达定位于PI染色阴性细胞，表明C6表达于中柱鞘细胞或者内皮层细胞。通过对质膜与细胞壁进行标记，发现mVENUS信号仅在中柱鞘细胞中可见，这表明C6特异表达于中柱鞘细胞（图3C）。通过对Est-1 和 c6 - 1 的感染进程观察，发现 C6 不影响根毛和表皮细胞的初级感染，但能阻止 Pb 在次生感染阶段对中柱薄壁细胞的定殖（图3E-F），从而保护中柱免受侵害。也因为这种抗性方式，研究人员将该基因以我国古代将军WeiTsing的名字命名。
图3C6阻碍Pb在的定殖
5.WTS的诱导表达产生抗性
为了深入了解WTS介导的根瘤病抗性，研究人员首先对继发性感染的早期阶段的Est-1和c6-1地下组织的转录组进行了分析。发现在根肿菌感染后，Est-1与C6-1相比，其地下组织中，包括SARD1、TIR1在内的抗病基因表达水平显著上调，这表明Pb诱导表达的WTS激活了植物体免疫应答（图4A）。并且作者通过在本氏烟草中瞬时表达雌二醇诱导的WTS，引发了酚类化合物的强烈积累，这表明，在没有病原体感染的情况下，WTS的异位表达也足以触发植物体的防御机制（图4G）。
进一步地，研究人员通过共免疫沉淀（co-IP）实验发现WTS具有自结合（图4H）。通过Native PAGE验证了其可形成寡聚体（图4I）。通过烟草瞬时表达，发现WTS基因定位于内质网上（图4J）。
图4 WTS形成寡聚物并受诱导表达激活抗性
6. WTS复合体形成离子通道
研究人员在酵母中表达了重组WTS蛋白，经凝胶过滤纯化后的蛋白分子量大于100 kDa（与WTS寡聚物一致）。进一步通过冷冻电镜（cryo - EM）确定了WTS 的结构，其呈现五聚体架构。WTS 每个亚基包含 4 个跨膜螺旋（TM），形成类似离子通道的结构，其孔径和表面电荷分布表明它可能是一种阳离子选择性通道（图5，6）。
图5 WTS通道的体系结构
图6 WTS形成Ca2+选择性通道
7.WTS复合体是一种Ca2+渗透性阳离子选择通道
为了确定WTS是否可以作为离子通道，研究人员将纯化的WTS蛋白纳入平面脂质双分子层（PLB）并进行单通道记录（图6E-6H）。在对称NaCl溶液中，对跨室施加一系列TM电压，记录迹中出现频繁的电流波动，表明WTS介导离子运动。通过用大的不可渗透离子替换记录溶液中的 Cl⁻或 Na⁺，发现用葡糖酸盐替换Cl⁻时电流模式相似，而用 TEA⁺（半径约 3.85A）替换 Na⁺时离子运动被阻止，说明电流由阳离子通量引起，WTS 形成的离子通道对阳离子具有选择性。
进一步地，研究人员在非洲爪蟾卵母细胞中表达的WTS-EGFP融合蛋白，并使用双电极电压钳（TEVC）测量质膜通道活性，通过电生理技术证实WTS介导Ga2+内流。
8.WTS介导的[Ca2+]cyt增加和植株抗性依赖于WTS通道的组装和活性
WTS的五聚体组装主要由邻近原聚体的TM1和TM2螺旋通过疏水相互作用介导。参与这些疏水相互作用的残基包括来自TM1的A27、V31、V35、L42和L45以及来自TM2的C64、L68、V75和M79（图7A）。这些残基同时被TM1（TM1- 4a）或TM2 （TM2- 4a）中的丙氨酸取代时，可消除拟南芥原生质体中低聚物的形成（图7B）。在K-葡萄糖酸盐溶液中，TM1-4A和TM2-4A突变几乎消除了卵母细胞中WTS通道的活性，表明通道活性需要五聚体寡聚（图7C）。
研究人员进一步在烟草中瞬时表达C7基因和WTS突变型，结果显示雌二醇诱导的野生型WTS表达相比于C7和WTS突变型明显升高了[Ca2+]cyt（图7H-I），表明植物中[Ca2+]cyt的增加依赖于WTS通道活性。为了确定WTS通道活性和[Ca2+]cyt增加是否与防御有关，研究人员检测了C7和WTS突变型诱导植物中酚类化合物积累的能力，而当这些突变型在烟草中瞬时表达时，没有观察到酚积累（图7J）。证实WTS触发的防御和抗病需要其通道活性和[Ca2+]cyt增加。
图7 五聚体的形成和通道活性对[Ca2+]cyt的增加和防御至关重要
