文献速览
灰斑病、大斑病和小斑病是三种对玉米最具破坏性的叶部病害。作者鉴定出抗病基因ZmCPK39，该基因编码一种钙依赖性蛋白激酶，并负向调节对这三种病害的抗性。抗性品系中的ZmCPK39的表达明显低于感病品系中的表达。ZmCPK39丰度的显著降低减轻了转录因子ZmDi19的磷酸化和降解。这导致已知编码抗菌蛋白的基因ZmPR10表达升高，从而增强了抗性。此外，ZmCPK39表达降低的F1杂交种有利于抗病，从而提高产量。因此，ZmCPK39–ZmDi19–ZmPR10免疫模块的发现，不仅有助于理解广谱抗病机制，而且为玉米叶部病害的遗传调控提供了新的途径。
研究结果
ZmCPK39克隆及功能验证
作者之前在抗病品系Y32与感病品系Q11杂交得到的一个作图群体中定位了一个抗玉米灰斑病QTL qRgls2。qRgls2被定位到5号染色体着丝粒附近的约1.1Mb区间，之后作者通过精细定位将qRgls2定位在标记M33和M19两侧的78 kb区间，包含三个注释基因。之后通过近等基因系的转录组差异表达分析和双亲基因序列分析，ZmCPK39是qRgls2的候选基因。之后作者通过转基因、基因编辑、过表达、RNA干扰及遗传实验证明ZmCPK39为qRgls2的功能基因，且其表达水平与GLS抗性呈负相关。同时作者分别在田间和温室中评估了ZmCPK39-OE(proUbi:YT01)和ZmCPK39-KO大小斑病的抗性。发现与野生型B73相比，ZmCPK39-OE植物对NLB和SLB更敏感，而ZmCPK39-KO植物对NLB和SLB表现出更高的抗性。因此得出ZmCPK39表达水平也与玉米对NLB和SLB的抗性呈负相关。
图1 ZmCPK39的克隆及负调控灰斑病、大斑病和小斑病抗性
ZmDi19参与ZmCPK39介导的免疫模块
作者通过酵母双杂鉴定出四种与ZmCPK39相互作用的蛋白质。之后通过基因编辑技术分别创建了B73背景下这些基因的突变体，之后发现与B73相比，ZmDi19-KO对GLS的抗性显著降低，而其它几个突变体对GLS的抗性没有差异。因此，只有ZmDi19与ZmCPK39介导的GLS的免疫信号有关。之后作者通过SLC，Co-IP，pull-down试验证实了 ZmCPK39和ZmDi19之间的相互作用。之后作者通过在本氏烟叶中共表达ZmCPK39–mCherry和ZmDi19–GFP证实了ZmCPK39和ZmDi19在质膜上共定位。然后，进行了双分子荧光互补(BiFC)测定，进一步阐明了在本氏烟中瞬时表达时ZmCPK39和ZmDi19在质膜上的相互作用。之后作者通过利用转基因功能验证试验，证明了ZmDi19正调控灰斑病、大斑病和小斑病抗性。
图2 ZmDi19与ZmCPK39相互作用并正向调控玉米对GLS、NLB和SLB的抗性
ZmCPK39磷酸化并降解ZmDi19蛋白
由于ZmCPK39与ZmDi19相互作用，并且在玉米抗GLS、NLB和SLB方面以与ZmDi19相反的方式发挥作用，作者推断ZmCPK39和ZmDi19可能起拮抗作用。为了解析二者的相互作用关系，作者通过生化实验证明，ZmCPK39通过转录后调控ZmDi19的蛋白稳定性。鉴于ZmCPK39具有蛋白激酶功能并导致ZmDi19降解，推断ZmCPK39可能磷酸化ZmDi19以促进其降解。利用质谱分析，作者鉴定到六个磷酸化修饰位点，并通过点突变实验发现ZmDi19蛋白第117位Ser的磷酸化状态对其蛋白稳定性起着至关重要的作用，其磷酸化促进了ZmDi19的降解。
图3 ZmCPK39通过对ZmDi19的Ser-117位点进行磷酸化来降解
ZmDi19调控ZmPR10基因的表达
为了明确转录因子ZmDi19调控的下游靶标基因，作者分析了ZmDi19-OE3转基因系与其受体系B73之间未感染叶组织的转录组和蛋白质组的差异，通过分析初步确定了八个候选靶标基因。通过酵母单杂交技术，证实ZmDi19仅与基因ZmPR10的启动子结合。利用表达调控实验，最终确定了ZmDi9正调控ZmPR10基因的表达，ZmDi19可以激活ZmPR10的转录，可能是通过在TACAAT处与其启动子结合来实现的。为了确认该基因是否也参与抗病反应，作者在B73背景下过表达 ZmPR10。所有ZmPR10-OE系的ZmPR10表达水平都远高于B73，并且与B73相比，GLS、NLB和SLB抗性有所增强。此外通过病原菌生长抑制实验进一步证明，ZmPR10能够抑制病原菌的生长和入侵，从而正调控玉米的抗病性。
图4 ZmDi19激活ZmPR10基因表达并正向调控玉米对GLS、NLB和SLB的抗性。
ZmCPK39、ZmDi19和ZmPR10基因的动态表达
将玉米穗腐病菌接种到近等基因系中，并监测了ZmCPK39、ZmDi19和ZmPR10基因的表达情况。作者发现1）ZmCPK39的等位基因变异导致其在响应病原体攻击时出现差异表达水平；2）ZmCPK39导致ZmDi19降解，但几乎不影响ZmDi19的基因表达；3）ZmDi19激活ZmPR10的基因表达，比ZmCPK39晚约2小时达到峰值。
图5 ZmCPK39、ZmDi19和ZmPR10基因的动态表达
降低ZmCPK39表达提高抗病性和产量
较低的ZmCPK39表达与对GLS的较高抗性相关，作者假设下调ZmCPK39可能会提高抗病性和产量。作者通过对转基因株系进行田间调查和2020年和2021年，在田间对两组F1杂种进行了小规模试验，结果表明在F1杂交种中引入单个ZmCPK39功能缺失的基因可以增强GLS抗性，以减轻相关的产量损失，同时在没有GLS的情况下将产量损失降至最低。
图6 ZmCPK39对普通田间和病害圃中F1杂种农艺性状及GLS抗性的遗传效应
ZmCPK39–ZmDi19–ZmPR10免疫模块的工作模型
最后作者提出了ZmCPK39的工作模型，模型表明，在病原体攻击后，抗病ZmCPK39Y32和感病ZmCPK39Q11等位基因都会被诱导，其中 ZmCPK39Y32的表达水平为ZmCPK39Q11的一半至三分之二。ZmCPK39Y32的相对丰度较低导致下游转录因子ZmDi19的磷酸化和降解降低。因此，较高的ZmDi19丰度会导致ZmPR10表达增加，从而增强玉米对GLS、NLB和SLB的抗性。相反，感病ZmCPK39Q11等位基因对病原体攻击表现出敏感性，因为其较高的丰度会导致ZmDi19磷酸化和降解增加，从而导致ZmPR10表达降低和抗病性降低。总之，作者的研究表明，玉米中的天然ZmCPK39抗性等位基因通过ZmCPK39–ZmDi19–ZmPR10免疫途径实现对多种叶面病害的抗性。
图7 ZmCPK39介导的玉米抗GLS、NLB和SLB的工作模型
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41588-024-01968-4
