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文章来源于分子庄园，作者木子庄主
1、PCR仪的分类
根据DNA扩增的目的和检测的标准，可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR仪，原位PCR仪，实时荧光定量PCR仪四类。
a.普通的PCR仪
一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪，主要是做一些简单的、对单一退火温度的目的基因进行扩增。
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b.梯度PCR仪
一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（温度梯度，通常有12种温度梯度）的PCR仪称作梯度PCR仪。
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梯度PCR仪主要用于研究未知DNA退火温度的扩增，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增，就可以筛选出表达量高的最适退火温度，进行有效的扩增。
这样既节约时间，也节约成本，在不设置梯度的情况下亦可当做普通的PCR用。
c.原位PCR仪
用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪称作原位PCR仪。如病源基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。
是保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在位置上进行基因扩增。
不但可以检测到靶DNA，又能标出靶序列在细胞内的位置，对于在分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转变有重大的实用价值。
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原位PCR仪主要应用于：
Ⅰ.检测外源性基因片段，提高检出率，集中在病毒感染的检查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；
Ⅱ.观察病原体在体内分布规律；
Ⅲ.内源性基因片段，如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、Ig的mRNA片段、癌基因片段等；
Ⅳ.检测导入基因；
Ⅴ.遗传病基因检测如β－地中海贫血。
d.实时荧光定量PCR仪
在普通PCR仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统的PCR仪称作荧光定量PCR仪。
其PCR扩增原理和普通PCR仪扩增原理相同，只是PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。
扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出，这种PCR仪叫做实时荧光定量PCR仪（qPCR仪）。
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荧光定量PCR仪有单通道、双通道和多通道。当只用一种荧光探针标记的时候，选用单通道，有多荧光标记的时候用多通道。数字PCR即Digital PCR（dPCR)，它是一种核酸分子定量技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的定量。仪器通常包括四个部分：光源系统、荧光检测系统、温控系统和分析软件。![]()
由于荧光体的荧光强度与激发光的强度成正比，因此，作为理想的激发光源应具备：足够的强度，在所需光谱范围内有连续的光谱，其强度与波长无关，即光源的输出应是连续平滑等强度的辐射，光强稳定。用于提供激发光源。通常采用高亮度LED或卤钨灯、氙灯、激光等光源，能够提供稳定的荧光激发光。![]()
激光是纯粹的单色光，用来做荧光染料的激发光强度超级高而且基本上没有背景干扰，但激光光源的价格也和性能一样高高在上，市场上只有最高端的定量PCR设备才会使用激光光源。相对于中低端设备使用的单色LED而言，卤钨灯或者氙灯的价格比较贵，需要定期维护和更换，但激发光的光谱范围比较宽，相对光强也较强。卤素灯：封装卤气的白炽灯泡，统称为卤素灯。与普通白炽灯相比，卤素灯更亮、寿命更长。
汞灯：汞灯是一种气体放电光源，是初期荧光计的主要激发光源。它是利用汞蒸气放电发光的光源。它所发射的光谱与灯的汞蒸气气压有关。单色LED光源光源成本低、使用寿命长，使用期间基本无需维护，在现在的中低端定量PCR市场中几乎占据统治地位；而近几年发展起来的白光LED，兼具卤钨灯光谱范围宽和LED性能稳定寿命的优点，在中高端定量PCR仪中使用较多。在定量PCR设备中主要使用滤光片进行单色滤光，光栅型单色系统在定量PCR设备中比较少见。高压氙弧灯是目前荧光分析仪器中应用最广泛的一种光源。这种灯的灯管是用耐高温、热膨胀系数小的透明石英管做成，管内充有高纯度的氙气。通电时，氙气受激发，射出强烈的白光。荧光检测系统一般由传输荧光的光学系统和探测、处理荧光信号的电子系统组成。由于激发光源发出的光是散射光，需要通过透镜变成平行光。蓝色的光谱特性包含了其他杂散光对系统造成干扰，为此需要合适的滤镜滤除不必要的波段。激发光通过二向色镜发生反射，再通过透镜聚焦到样本，激发荧光物质发出荧光。荧光物质发出的荧光通过透镜形成平行光，只有在透镜焦点附近的荧光才能进入成像系统，这样可以避免其他杂光的干扰，从光学上提高信噪比。由于二向色镜的特性，对于大于一定波长范围的光可以透过二向色镜而不会发生反射，荧光穿过二向色镜通过透镜会聚到焦点进入光电探测器。因为透过的荧光不可避免的夹杂着其他光学信息如环境光、激发光、其它荧光物质发出的光等，可进一步通过窄带滤波片滤除杂散光，提高特异性。由于入射光和发射光的方向垂直相交，为此需要使用二向色滤光片将入射光尽可能反射到样本上激发荧光物质而不要透过该滤光片，发射的荧光尽可能地透过二向色滤光片而不发生反射，同时过滤部分通过试管反射的激发光。二向色滤光片是具有两向色性的分光板，其特性是反射短波光线，透过长波光线。由于光源波长和荧光波长互不重叠，选择合适的二向色滤光片可以很好地满足上述要求。用于收集PCR反应体系中荧光信号，并将其转换为电信号。![]()
定量PCR设备的荧光检测元件常见的有两种，光电倍增管（PMT）和CCD/CMOS芯片。光电倍增管是依据光电子发射、二次电子发射和电子光学的原理制成的、透明真空壳体内装有特殊电极的器件。![]()
PMT多用于中低端设备，使用扫描检测模式，在灵敏度上PMT几乎可以达到CCD/CMOS检测的同等水平，但由于光电倍增的工作原理，使用PMT检测一般背景噪音会相对较高，信号基线不够稳定，尤其在孔间和板间重复性上表现明显弱于CCD/CMOS类型的检测设备。Charge Coupled Device (CCD)是一种新型光电转换器件，它能存储由光产生的信号电荷。当对它施加特定时序的脉冲时，其存储的信号电荷便可在CCD内作定向传输而实现自扫描。CCD/CMOS价格比较高，一般用于中高端定量PCR设备，使用CCD/CMOS检测的设备一般在孔间重复性上明显好于扫描设备，复孔之间的实验结果相对偏离会较小。目前市场上还有一些使用光电二极管（PDT）检测的定量PCR设备，它的成本与PMT相当，而检测结果的背景噪音低则于PMT设备，但由于信号放大过程后置，所以检测灵敏度要低于使用PMT和CCD/CMOS的设备，直接表现就是检测同一样本时Ct值出得会比较大。![]()
光电二极管和普通二极管一样，也是由一个结组成的半导体器件，也具有单方向导电特性。定量PCR设备通过激发和发射滤光片的不同组合，可以同时检测多种不同的荧光染料，也就是我们所说的检测通道数。![]()
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3）温控系统
用于控制PCR反应体系的温度，保证PCR反应的进行。
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常见的热循环模块一般是使用半导体温控的金属模块，此外，还有几种使用类似离心机转子式的空气温控组件，这是通过控制进入离心腔体里的空气温度来实现精确温控。使用传统的加热模块，最需要关注的边际效应问题，由于与外界更加剧烈的热交换过程，靠近模块边缘的孔往往扩增效果与靠近中心的反应孔有差异。一般半导体温控原件的功率和性能越好，则边际效应影响程度就越低。![]()
传统仪器的中心强、两边弱的光学边缘效可通过ROX被动染料校正。数据分析软件用于处理和分析PCR反应产生的数据，包括荧光信号强度、扩增曲线、熔解曲线等。![]()
1）Peltier模块
热循环仪中所使用的固定状态的Peltier模块可通过控制电流的方向来实现加热和冷却的功能，更为先进的Peltier系统可实现更为快速的（如每秒6°C）模块加热和冷却过程。Peltier模块的基本原理：两种不同的材料（在这里是半导体）被连接时，根据不同的电流方向会产生热或发生热吸收。
2）热盖
热盖是用于防止运行过程中PCR样品的蒸发和浓缩。在热盖被发明之前，样品会通过矿物油的覆盖来达到同样的目的。
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由于引物和靶标序列之间的退火过程对于成功获取PCR结果至关重要，退火温度通常都需要进行优化。为了实现对于不同温度的同时检测，梯度热模块被开发出来，以实现在单一金属模块两端设置接近理论退火温度的高、低温（A）。也有一种“Better-than-gradient”技术，通过使用绝热的独立热模块来取代单一的模块（B）。![]()
梯度设定的目的是在模块之间实现不同温度，通过每列之间≥2°C的间隔温度的增加/降低，使得可同时对于一系列的温度进行测试以获取最佳的引物退火温度。理论上，真正的梯度可在模块之间实现线性的温度。然而，梯度PCR仪通常只采用单一的热模块并通过位于两端的两个加热及冷却元件进行温度的控制。
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该设计仅能设置两个温度：在热模块的两端设置成引物退火的最高、最低温度。因此，无法在模块间实现其他温度的精准设置。由于不同列之间的热交换，模块上不同区域之间的温度更可能遵循的是S形的曲线变化而非真正的线性梯度。![]()
具有“better-than-gradient（优于传统梯度）”技术的PCR热循环仪可实现更好的引物退火温度控制。该技术的一种形式便是设计带有三个或更多分隔金属模块的热循环仪，每一模块都具有独立的加热和冷却元件。
相比于梯度模块，该模块设计可带来：独立设置三种或更多不同温度的能力，以便使得每个独立的区域都能进行更好的温度控制，特别是在温度优化过程中。独立金属模块的绝热性阻止了模块之间的热传递。这就可实现更为精准的模块温度控制，确保模块之间实现真正线性的温度变化。
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4）升降温速度控制
PCR仪的升降温速度意味着在一定时间内发生的PCR步骤之间的温度变化，并通过用摄氏度每秒(°C/sec)作为单位。相应的“升温”和“降温”分别代表着热模块的加热和冷却过程。
由于热量从模块传输至样品需要一定的时间，样品实际的升降温速度会较慢（相对于模块）。
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模块的热过冲可让样品更快达到期望的温度。橙色和蓝色散点曲线描绘了在没有模块热过冲的情况下模块和样品的温度。
PCR热循环仪应该被设计成只有样品达到设置的温度后才对相应的步骤开始计时。这样维持时间，或样品维持在设定温度的时间，将会与操作流程中要求的相应循环条件保持得更加准确。
4）PCR仪的三种控温模式
在进行PCR仪中控温模式设定时，一般有三个选项：Block、Tube及Probe。
a.Block模式
PCR仪的温度传感器一般是在模块下面的，也就是说仪器实际能够控制的是模块的温度，Block模式指的就是仪器以控制Block的温度为目的，也就是说你输入95度5分钟，则模块的温度达到95度后开始计时，5分钟后完成。这是最基本的控温模式。
b.Tube模式
但是，实际上我们输入95度5分钟是希望PCR管内的温度达到95后开始计时5分钟。PCR仪器开发人员可以先将模块温度控制到97度（比如而已，如果不超过95度，管内温度可以很长时间才能达到95度或根本达不到），过几秒钟后，等到管内温度达到95度，再将模块温度降到95度。这样做既达到了管内温度到95度，且速度较快。
但过冲的温度量与时间及PCR管的导热系数、PCR反应液的体积都有关系。这就是各个PCR仪厂家的核心技术了。这种控温方式就称为Tube模式。
c.Probe模式
如果直接将一个温度传感器加入PCR管中，直接测量PCR管内的温度不是也可以吗？这就是Probe模式，也就是在一个不进行PCR反应的管内放入一个温度探头，仪器根据温度探头测到的温度来控制PCR管内的温度。
但传感器的数据检测、分析及反馈是需要时间的，这种控制模式不一定比Tube模式好，而且如果反应体积发生变化时，就比较麻烦了。
5）关于PCR仪的体积设定
PCR 仪设置体积对应一定的加热高度，主要和PCR管的加热面积区域大小有关，一般要求大于等于配置的PCR体系。
参考文献：
［1］热循环仪概览--历史与进展-Thermo Fisher官网
［2］VeriFlex temperature control technology for thermal cycling-Thermo Fisher官网［3］热循环仪特点--6项关键考虑因素-Thermo Fisher官网［5］漫话qPCR | 仪器怎么选? 拆机看构造才心里有数 -AppliedBiosystems［6］荧光定量PCR的各组成部件及其功能特点分享-LUMEX鲁美科思分析仪器［7］荧光定量PCR的技术原理和应用-罗氏诊断应用专员：林炎城［9］PCR仪的三种控温模式介绍-迪图生物科技有限公司［10］关于PCR反应体积设置与实际体积不同的情况对实验结果的影响-小木虫
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