文章来源于分子庄园，作者木子庄主
一步法和两步法是两种最常用的RT-PCR方法，每种方法都具有各自的优缺点。
一、一步法RT-PCR
一步法RT-PCR指在单个反应管中进行第一链cDNA合成和后续PCR反应。
1、优点
该反应设置消除了样品转移步骤，控制了污染的潜在来源，简化工作流程，特别适用于大量样本的应用。当时间对实验很重要时，一般采用一步法，如检测RNA病毒。
而且在RT-PCR中使用的是基因特异性引物，有助于最大化目标cDNA的得率，并最小化扩增背景，常用于分析低表达水平基因。由于该法的检测结果准确率高，因而在需要测量表达水平上的细微差异时，也可采用此方法。
2、缺点
一步法RT-PCR采用基因特异性引物进行扩增，将分析局限于每个RNA样本中的几个基因。由于反应需兼顾逆转录和扩增条件，因此一步法RT-PCR在某些情况下可能具有较低的灵敏度和效率。
RT和PCR均是酶促反应，核心酶是Reverse Transcriptase和DNA Polymerase。而两个酶促反应在同一体系下进行，必然会牺牲其中之一的性能。
1）RT反应影响
①一步法RT-PCR使用基因特异性引物，对模板RNA质量要求较高，RNA质量的优劣严重影响逆转录效率。
②两步法RT-PCR的RT过程使用Oligo dT和Random Primer最适比例混合液作为引物，就反转录产量和效率而言，一步法RT-PCR使用的基因特异性引物低于Oligo dT和Random Primer。
③Reverse Transcriptase最适酶活温度多为37-50℃，而在37-50℃条件下，上下游引物3´末端易发生退火，极易造成引物二聚体的形成。
2）PCR反应影响
引物二聚体和逆转录体系中某些组分的抑制会影响PCR扩增效率。
二、两步法RT-PCR
包含两个独立反应，先进行第一链cDNA合成，然后再通过PCR扩增第一步骤中所得cDNA。
1、优点
1）RT过程
①使用Oligo dT和Random Primer最适比例混合液作为引物，对RNA模板的要求宽泛，如大多数RT Enzymes对1ng-1μg起始模板量总RNA都可高效率逆转录。
②两步RT-PCR可将大批量的RNA转化为cDNA，然后储存cDNA用于后续实验，不仅可检测大量基因，而且得到的cDNA还可用于文库构建或基因克隆等，应用更广泛。
2）PCR过程
①扩增效率高：RT过程产生的cDNA，可经5-20倍稀释，任何可能从RNA分离到RT反应的抑制剂（如乙醇、酚及胍盐等）都被稀释了，最大程度上减少对PCR反应的抑制。
②高通量多基因定量：逆转录得到cDNA样品，可同时实现多个基因检测。
③RT和PCR反应独立进行，可更好地对每个步骤的反应条件进行优化，使逆转录引物选择（oligo dT引物、随机六聚体或基因特异性引物）和PCR反应建立（如DNA聚合酶选择和PCR组分）更灵活。
2、缺点
与一步法RT-PCR相比，两步法RT-PCR的缺点包括多个步骤延长了工作流程、增加样本处理和操作步骤，可能会增大误差以及交叉污染和结果变异的可能性。
三、第二链cDNA合成
将第一链cDNA作为模板，生成第一链cDNA的互补链，获得双链cDNA的过程被称为第二链cDNA合成。在第一链cDNA合成中，推荐使用RNase H活性最小的反转录酶，从而最大限度地增加第一链cDNA合成长度和产量，有利于第二链cDNA的合成。
1、置换合成法
在dNTP存在下，利用RNase H在DNA/RNA杂交链的RNA链上造成切口和缺口，从而产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA polymerase I的作用下合成第二链。
1）具体步骤
①E. coli RNase H切割cDNA／RNA复合物中的RNA链，为DNA合成提供3'-OH引物结合位点。
②E. coli DNA polymerase I利用5´→3´聚合酶活性延伸切口RNA链，并利用5´→3´外切核酸酶活性沿合成方向替换RNA链，该过程被称为切口平移。
③E. coli DNA ligase缝合新合成cDNA片段之间的切口（不建议用T4 DNA连接酶，因为它会连接双链cDNA平末端片段并形成嵌合结构）。
④遗留在5'-末端的一段很小的mRNA也被大肠杆菌DNA聚合酶I的5´→3'核酸外切酶和RNase H降解，暴露出与第一链cDNA对应的3'端部分序列。同时，大肠杆菌DNA聚合酶I的3´→5'核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链cDNA的3'端部分消化掉，形成平端或差不多的平端。
这种方法合成的cDNA在5'端存在几个核苷酸缺失，但一般不影响编码区的完整。
2）T4 DNA聚合酶特性
T4 DNA聚合酶具依赖DNA模板的5´→3´聚合酶活性，同时具有对单链、双链DNA的3´→5´端的外切酶活性，缺少5´→3´端的外切酶活性。双链DNA片段在无dNTP存在下与T4 聚合酶温育，其3´末瑞的外切酶活性将导致从3´末端降解DNA，当补加4种dNTP后，可激活其聚合酶活性，延伸DNA模板的3´末端，在高浓度dNTP存在下，酶促的降解反应终止于双链区，此特性可用于双链DNA分子的3´末端标记。
2、自身引导法
用NaOH消化DNA/RNA杂合链中的mRNA链后，解离的第一链cDNA的3´末端会形成一个发夹环(发夹环的产生是第一链cDNA合成时的特性，原因未知，据推测可能是和帽子的特殊结构相关)，这为第二链的合成提供了现成的引物，在E. coli DNA polymerase I的Klenow片段或反转录酶（DNA指导的DNA聚合酶活性）的作用下延伸为cDNA第二链，最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环。
因自身引导合成法较难控制反应,而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA的5´端序列出现缺失和重排,因而该方法很少使用。
3、引物-衔接头法
即利用MMLV的末端转移酶TdT活性（SuperScript IV和Maxima H Minus均有，而SuperScript III 没有该活性），该酶经过突变丧失了RNaseH活性，且会在第一链末端添加CCC碱基，因此我们可以在反应中直接添加包含有GGG的TSO序列，就可以以第一链cDNA为模版合成第二链cDNA。此特性还常用于单细胞SMART-seq中的Template switching反应或5´RACE等实验。
几种反转录酶突变种：
①M-MLV逆转录酶：优异的热稳定性，在37℃下具有最佳活性；可用于合成长达7kb的第一链cDNA。
②SuperScript III转录酶（37℃-55℃）：可在高达 55°C 的温度下合成第一链cDNA，cDNA可生成 100 bp至>12kb，提高了特异性，有cDNA和全长产物的高产量。
③SuperScript IV逆转录酶（42℃-55℃）：显著提高对可能干扰 cDNA 合成的抑制剂的耐受性，能在多种样品类型中进行稳定而特异性的cDNA合成；更快的逆转录酶反应将孵育时间从>50min缩短到10min，与 SuperScript III相比，具有更好的持续合成能力。
④Maxima H 减去逆转录酶（50℃-55℃）：在 50℃下在反应混合物中孵育60min后任具有90% 的热稳定性，工作温度可高达65℃；全长cDNA产量高达20kb；可从各种起始总RNA（1pg至5μg）中合成高灵敏度、可重复的cDNA；在15至30min内高效完成cDNA的合成；增加了对常见反应抑制剂的耐受性；可掺入修饰的核苷酸。
文章来源于分子庄园，作者木子庄主
