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研究背景
女性生育年龄的推迟将导致在尝试怀孕时出现严重的不孕问题。据报道，女性生育能力的下降与其生殖器官（包括卵巢和子宫）中与年龄相关的氧化应激有关。氧化应激是由于自由基在细胞内逐渐积累而产生的。在正常代谢或病理条件下，氧化应激被认为是生物体衰老的主要机制之一。随着卵巢的衰老，氧化应激可能引起卵泡闭锁，导致卵母细胞数量和质量下降。自由基的形成增加对卵母细胞成熟、受精、胚胎发育、怀孕以至产仔数等多个生理过程产生负面影响。所有这些都会导致与年龄相关的生育能力下降。补充抗氧化剂可减轻氧化应激，维持包括人类在内的哺乳动物卵母细胞和卵泡的数量和质量。越来越多的证据表明，强效抗氧化剂褪黑激素可能是改善女性衰老导致的生育能力下降的正确选择。褪黑激素是色氨酸的衍生物，在脊椎动物的松果体中产生，也在许多其他组织和器官中合成，包括卵巢、睾丸、骨髓、视网膜和晶状体。它阻止线粒体释放细胞色素c并防止细胞凋亡。褪黑激素是一种有效的自由基清除剂和抗氧化剂。可直接清除 ROS、刺激抗氧化酶、增加谷胱甘肽 (GSH) 水平并抑制细胞和器官中的促氧化酶。它可以调节 sirtuins31的表达，sirtuins属于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖性脱乙酰酶家族。该家族（如SIRT1）参与衰老的调节。在这项研究中，研究人员将研究褪黑素是否能有效防止雌性小鼠因年龄增长而导致的生育能力下降。
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研究结果
1. 长期补充褪黑素可增加产仔数
研究者建立褪黑素治疗的小鼠模型，结果显示，24周龄时各褪黑素组的产仔数均大于对照组。在32、40和48周龄时，接受褪黑激素治疗的小鼠仍然比对照组产生了更多的后代。
2. 长期褪黑素治疗对卵母细胞质量和数量的影响
将小鼠进行超数排卵，随后进行体外受精。以8周龄相对幼鼠作为对照。根据形态学变化，将卵母细胞分为正常和异常两组。结果显示，24周龄小鼠经褪黑素处理后，均显著高于未处理组。褪黑素组小鼠的异常卵母细胞数显著少于未处理小鼠。正常卵母细胞受精后体外培养至囊胚期。褪黑素组的囊胚率显著高于未治疗组。将8周龄和24周龄褪黑素治疗组和未治疗组的小鼠的囊胚分别移植到假妊娠受体小鼠的子宫角中。8周龄小鼠的平均后代数量最多。然而，褪黑素治疗组小鼠的平均后代数量也显著高于未治疗组小鼠。结果表明，小鼠补充褪黑激素后卵母细胞的质量和数量均得到显著改善。
3. 褪黑素通过MT1提高卵巢抗氧化能力并减少卵母细胞中ROS形成
为评估氧化应激，研究者在卵巢和子宫中检测了MDA、SOD和TAOC水平。褪黑素治疗组的SOD活性和TAOC水平显着高于年龄匹配的未治疗组。相反，前者的MDA水平明显低于后者。这与在卵母细胞中检测到的ROS水平一致，即未治疗小鼠的ROS水平较高，而褪黑素组的ROS水平较低。此外，未治疗小鼠的卵母细胞线粒体膜电位降低，褪黑素治疗可挽救这种降低。鉴于已发现AMPK激活可促进整体健康并保护细胞免受氧化应激引起的衰老，因此评估AMPK、p-AMPK和MT1在蛋白质水平上的表达。观察到接受褪黑素治疗的小鼠卵巢中AMPK和p-AMPK显著上调，与未接受治疗的动物相比，该组的MT1也上调。但是，p-AMPK/AMPK的比例并未受到褪黑素治疗的显著影响。因此推断褪黑素通过调控MT1发挥作用。
4.MT1 基因敲除损害雌性小鼠的生育能力
为了确认MT1是否介导褪黑素对卵巢的有益作用，研究人员将MT1基因从第1和第2个外显子中删除。通过使用PCR和基因型测序进行了确认。记录了雌性MT1-KO小鼠的生育能力，并选择了一些小鼠来评估卵巢产生卵母细胞的能力。在48周的时间内，分别记录了8、16、24、32、40和48周龄的产仔数。记录显示，除32周龄外，所有时间点MT1-KO小鼠的产仔数均显著低于野生型小鼠。此外，与野生型小鼠相比，12岁和36岁时MT1-KO小鼠收获的正常形态卵母细胞较少，但在48周龄时，两组小鼠均未收获足够的卵母细胞。所有结果证实MT1参与了卵母细胞质量的提高。
5. MTNR1A缺失改变小鼠抗氧化和衰老相关基因的表达
为进一步探讨MT1在小鼠卵巢中的潜在分子机制，分析了SIRT1、SIRT2、MLH1、C-myc、Bcl-2、GPx1、SOD、BAD、BAX、bcl-2、p53、GPx1、SOD、CHOP、Hsp70等一系列抗衰老相关基因的表达情况。结果显示，与12周龄WT小鼠相比，MT1-KO小鼠的SIRT1、C-myc、Bcl-2、Gpx-1、BAX、CHOP、Hsp70的相对表达水平下调，两组间SIRT2、MLH1、SOD、p53、BAX的表达无差异。36周龄时，与对照组相比，MT1‐KO小鼠卵巢中SIRT1、C‐myc、SOD、p53、Gpx‐1、BAD、BAX、CHOP和Hsp70的表达下调。两组之间SIRT2、MLH1和Bcl-2的表达无差异。48周龄时，除MT1‐KO小鼠卵巢中的SIRT1、C‐myc、CHOP和p53仍高于WT小鼠外，其他8个基因的表达在所有小鼠中处于相同水平。然后，通过蛋白质印迹法评估SIRT1和潜在靶蛋白的表达。12周龄时，WT和MT1‐KO 小鼠卵巢中这三种蛋白的表达均无显著差异。而48周龄MT1-KO小鼠的SIRT1和磷酸化NF-kB表达升高，但乙酰化p53表达没有升高。
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研究结论
研究得出结论MT1敲除显著加速了小鼠的生育能力下降。该研究还探索了信号转导通路；该通路涉及 MT1/AMPK。这些观察结果为褪黑激素在老年动物中发挥的生殖生理学提供了新的见解。
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参考文献
Lu Zhang, Zhenzhen Zhang，Guoshi Liu, et, al. Melatonin regulates the activities of ovary and delays the fertility decline in female animals via MT1/AMPK pathway. J Pineal Res. 20198;66(3):e12550.
文献分享丨范志浩 审核丨侯栋
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