01 荧光PCR法
探针法在实时荧光PCR技术中扮演着关键角色，通过设计特异性的荧光探针，可以精确地识别目标序列，并对其进行定量检测，能够显著提高PCR扩增的特异性。然而，由于设计探针的过程较为复杂，因此相关试剂的成本也相对较高。与此相对，染料法试剂则更为便捷，因为染料已经预先混合在试剂中，无需额外设计探针，使用起来更为简便，且成本相对较低。在选择使用哪种试剂时，应根据具体的使用需求和预算进行综合考虑。
在25款获得国家药品监督管理局（NMPA）批准的肺炎支原体核酸检测试剂盒中，有20款采用了荧光PCR法，包括提取（常规）和非提取直扩（无需经过核酸提取纯化步骤）两种技术路线。
之前写过多篇文章介绍核酸提取，但
对非提取直扩了解较少，受限于篇幅，暂时不展开介绍，后续找机会深入学习
。
02 等温扩增技术
等温扩增技术是一种在恒定温度下进行核酸扩增的分子生物学方法，与传统的PCR技术相比，不需要热循环仪器，具有操作简便、反应速度快、灵敏度高、特异性强等优点，适用于多种领域，如疾病诊断、食品安全、环境监测等。
目前主流的恒温扩增技术包括LAMP（环介导等温扩增）、RPA（重组酶聚合酶扩增）、RAA（重组酶聚合酶扩增）、RCA（滚环扩增）、HDA（等温高灵敏度扩增）、SAT（序列特异性扩增技术）、CPA（等温扩增）以及NEAR（非扩增环介导等温扩增）等。
方法繁多，今天先学习NMPA批准的肺炎支原体核酸检测试剂盒中包含的几种方法。
LAMP
LAMP技术（环介导等温扩增技术）利用多对引物和Bst DNA聚合酶在恒定温度下进行反应。首先，通过引物和聚合酶的作用，形成哑铃状的中间产物，随后这些产物不断延伸和链置换，产生具有多个重复序列的DNA单链，从而实现靶基因的体外扩增。该反应通常设计有一对内引物（FIP、BIP）和一对外引物（F3、B3），总共可以识别目标DNA上的六个不同序列。有研究表明，通过增加一对环引物（LF、LB），可以进一步提高反应速率。由于使用的DNA聚合酶具有链置换活性，LAMP技术能够在恒温条件下进行，无需进行热循环，大大简化了实验操作。
LAMP技术通常被人为地划分为两个阶段，以更好地理解其扩增过程。
在初始阶段，聚合酶介导FIP引物与模板链上的F2c区域结合，并启动互补链的合成。随后，比FIP长度短、浓度较低的外引物F3与模板链上的互补区域F3c结合，并开始置换新合成的互补链。由于F1和F1c互补，被置换的链在末端形成茎环结构，并在3’端继续延伸。之后，BIP和B3引物与这条被置换下的链继续发生上述反应，最终产生所谓的哑铃状产物。
在循环扩增阶段，这些哑铃状的DNA片段成为了扩增循环的起点。在单链DNA自引物、FIP/BIP引物与茎环结构的结合处，或者环引物与茎环结构的结合处的3’端，聚合酶介导下发生DNA链的延伸。通过一系列快速且反复的延伸和置换反应，最终形成了大量长短不一、结构类似单体的茎环DNA单链，这些单链中包含有扩增的靶基因序列。
CPA
交叉引物恒温扩增技术（Crossing Priming Amplification，CPA）是优思达自主研发并拥有知识产权的核酸扩增技术。其工作原理基于特异性扩增引物、特异性荧光探针以及高活性逆转录酶和具有链置换特性的DNA聚合酶的协同作用。在恒定的温度下，该技术能够一次性完成靶标的特异性扩增过程，并通过荧光信号的实时检测，由适配的仪器自动生成相应的实时荧光曲线。
SAT
RNA实时荧光恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification and Testing，SAT）是仁度生物的核心恒温扩增技术。其反应过程如下：首先，靶标RNA在逆转录酶（RT酶）的作用下逆转录成一条带有T7启动子的双链DNA。接着，T7 RNA聚合酶以这条双链DNA为模板进行转录，每个cDNA分子可以转录出100-1000个拷贝的RNA。这些合成的RNA与分子信标结合，发出荧光，并可被荧光检测仪检测到。与此同时，新合成的RNA继续在RT酶和T7 RNA聚合酶的作用下进行逆转录和转录的循环过程，如此往复，实现对RNA的高效扩增。
双扩增方法（DAT）
双扩增技术（DAT）是基于中帜生物核心技术平台开发的核酸多重检测技术。该技术将RNA恒温扩增（多重NASBA）和多生物素信号放大（MBSA）相结合。
首先，对标本中的脱落细胞进行裂解，释放出的病原体RNA在逆转录酶和T7 RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病毒RNA的T7核酸扩增。扩增产物随后被加入到微孔板中，与特异探针和标记有多生物素的放大探针杂交，从而实现病原体靶核酸的信号放大。最后，通过HRP酶和底物的化学发光反应进行检测，实现多重病原体精准鉴别诊断。
RNA恒温扩增-金探针层析法（RGT）
RNA恒温扩增-金探针层析技术（RGT）是中帜生物独家开发的RNA快速检测技术，样本中的细胞经细胞裂解液直接裂解后，经过RNA恒温扩增与金探针层析技术，实现对病原体RNA分子的快速检测。
具体而言，首先，采集的标本经过细胞裂解液的处理，释放出病原体核酸。这些核酸在逆转录酶和T7 RNA聚合酶的协同作用下，经历逆转录和转录过程，从而实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别并捕获，形成RNA扩增产物-特异探针-金探针复合物。该复合物随后通过侧向流层析在硝酸纤维素（NC）膜上固定，形成可见的条带，从而实现病原体核酸的检测。
总结
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