免疫监测辅助难治性寻常型天疱疮诊疗的案例分析

（汇报人：张晰雯、严琳）

青年女性，32岁，2020年9月口腔黏膜出现糜烂，10月躯干出现水疱，2020-11-4于华西医院皮肤科就诊，行组织活检，皮肤直接免疫荧光报告显示:角质形成细胞间IgG网状阳性，C3网状阳性，IgM阴性，血清中天疱疮抗体阳性，确诊为寻常型天疱疮。

随后开始激素治疗，或激素联合利妥昔单抗、或激素联合多种免疫抑制剂治疗，或环磷酰胺冲击治疗等，但效果都不佳，病情易反复，易出现感染，下一步如何更好监测与评估患者治疗情况？

如前所述，患者经皮肤活检后免疫荧光染色显示，角质形成细胞间有免疫球蛋白沉积（图1），同时血清抗体桥粒芯糖蛋白1和3（Dsg1以及Dsg1）抗体水平均>100U/mL（图2），最终确诊“寻常型天疱疮”。

患者在治疗期间因效果一直不佳，故采用多种方案，2020-11-11开始启动强的松治疗（起始剂量45mg/天），因效果不佳，2021-2-5入院接受利妥昔单抗500mg静脉输注，但2月后皮肤仍有新发水疱，口腔黏膜完全愈合。2021-4-6再次接受利妥昔单抗600mg静脉输注。此后1年原有皮损逐渐愈合，但胸部、头面部部分皮损糜烂持续存在，激素逐渐减量。

激素减量期间皮肤偶有新发皮损，期间出现高血压、库欣综合征、白内障、停经、痤疮等激素相关不良反应，先后激素联合甲氨蝶呤、羟氯喹、硫唑嘌呤辅助免疫抑制治疗。

2022年5月新发皮损开始增多，2022-9-25入院接受利妥昔单抗输注1000mg，强的松15mg，后加用环孢素，皮损无明显变化。2023-2-22复诊时皮肤、黏膜再次出现较多新发病损，激素剂量加至甲泼尼龙24mg/天。2023-2-24、2023-3-8分别接受利妥昔单抗单抗治疗，四肢皮损有所好转，头面部、胸部顽固病灶持续未愈合，强的松25mg/天维持治疗4月。

2023-7-12躯干、四肢再次出现多处新发皮损，原有皮损扩大，2023-7-17接受重组人IL-2皮下注射20mg，病情有所控制，强的松减至20mg/天，2023-8-9接受第二次重组人IL-2皮下注射20mg，继续强的松20mg/天治疗3月，原有皮损无明显改变。2023-11-8复诊时头面部、四肢、躯干、口腔黏膜较多新发病损，强的松加至40mg/天联合吗替麦考酚酯1月，无明显好转。

2023-12-26、2024-1-23外院接受环磷酰胺冲击治疗，病情稍控制。2024-2-23因疾病突然明显加重，全身新发多处红斑、糜烂、皮肤大面积感染于我院住院治疗，住院期间先后接受静注免疫球蛋白、度普利尤单抗、托法替布，强的松25mg/天；2024-3-20出院时皮损部分好转，躯干仍有新发红斑、水疱。出院带药25mg/天维持至今，目前皮肤仍有新发水疱、胸部头皮多处糜烂未愈合。

鉴于多种免疫抑制治疗方式效果不佳，联合治疗中天疱疮致病自身抗体监测发现，抗体桥粒芯糖蛋白1和3（Dsg1以及Dsg1）抗体水平在一定程度上可反映疾病的治疗效果；利妥昔单抗治疗后的B淋巴细胞绝对计数及亚型分析可辅助判断药物效应。

1、外周血B细胞绝对计数的监测：

患者在初次启用利妥昔单抗前后，实验室持续动态的监测B细胞绝对计数，如图3所示：在使用后利妥昔单抗600mg静脉输注后，B细胞的绝对数量将至10个细胞/ul,之后持续使用利妥昔单抗600mg静脉输注，B细胞的数量持续低于10个细胞/ul，然而患者的临床症状并未得到改善。

后利妥昔单抗输注的剂量提高至1000mg，B细胞的数量降至5个细胞/ul以下，然而皮损未见明显变化，提示外周B细胞的数量在利妥昔单抗使用以后，降至检测底限。

B细胞绝对计数能很好的反映利妥昔单抗治疗药物效应，但本案例并未显示其在治疗效果评估中优势，分析原因，本患者胸部、头面部的反复难愈提示可能存在皮损部位的异位淋巴结构，导致局部B细胞活化及高水平自身抗体，并促进机体皮肤免疫损伤持续存在。

2、外周血抗体的监测：

天疱疮发病机制尚不清楚，目前认为抗桥粒芯糖蛋白1（Dsg1）和Dsg3抗体在诱发天疱疮水疱形成中起了主要作用。抗DSG1抗体和抗DSG3抗体定量检测，其水平与寻常型天疱疮（PV）疾病活动度、疾病严重程度及疾病治疗效果相关，可用于PV治疗监测。

《寻常型天疱疮诊断和治疗专家建议（2020）》中指出，“对同一患者在治疗的不同阶段，抗Dsg抗体水平可作为病情评估指标。如果在治疗期间抗体水平上升，提示病情可能复发或加重，需密切随访”。

本案例中患者在初次启用利妥昔单抗前后，实验室指标持续动态的监测自身抗体桥粒芯糖蛋白1和3（Dsg1以及Dsg1），如图2所示：在利妥昔单抗治疗早期有所降低，但2022年5月后升高并维持中高水平，其后随治疗未出现显著降低，其与患者病情一致。

3.外周血调节性T细胞的监测：患者使用低剂量IL-2治疗的过程中，持续监测Treg细胞的数量，如图3所示，治疗后Treg细胞的数量持续升高至38 cells/μl，绝对计数的表达较百分率更为敏感。

图1 皮肤组织直接免疫荧光 角质形成细胞之间的IgG沉积

图2 天疱疮疾病面积指数评分、抗体及B细胞变化情况

图3 外周血Treg细胞方案配色以及水平的变化

图4 治疗前患者外周B细胞亚群分析

1、 寻常型天疱疮（PV）的诊断 其诊断标准包括临床表现、组织病理与免疫诊断指标（血清抗表皮细胞间抗体或抗桥粒芯抗体等）。免疫诊断指标（3项）其中2项均为血清学中自身抗体指标，且免疫诊断指标是必备项。血清自身抗体检测是寻常型天疱疮诊断的重要指标。

本案例患者口腔黏膜糜烂，躯干出现水疱，皮肤免疫荧光染色显示角质形成细胞间IgG网状阳性，C3网状阳性；血清中抗Dsg1和Dsg3抗体均明显升高，其PV诊断明确。

2、 寻常型天疱疮的治疗 系统应用糖皮质激素是PV的一线治疗药物。此外，建议对中重度患者早期应用免疫抑制剂（因为免疫抑制剂起效大约需要1 ~ 2个月）。常用的免疫抑制剂包括吗替麦考酚酯、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢素等。

生物制剂利妥昔单抗通常作为系统糖皮质激素联合药物，也可和静脉滴注免疫球蛋白（IVIG）或免疫吸附联合用药。其他疗法还包括血浆置换、免疫吸附、干细胞移植等。

本案例中患者采用多种治疗方式，其中包括利妥昔单抗和重组人IL-2治疗。利妥昔单抗，是一种嵌合鼠/人的抗CD20分子单克隆抗体，能特异性地与跨膜抗原CD20结合。CD20抗原位于前B和成熟B淋巴细胞的表面，而造血干细胞、正常浆细胞或其它正常组织不表达CD20。利妥昔单抗与B淋巴细胞上的CD20结合，并引发B细胞溶解的免疫反应。

细胞溶解的可能机制包括补体依赖性的细胞毒性(CDC)和抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。第一次输注利妥昔单抗后，外周B淋巴细胞计数明显下降，低于正常水平，6个月后开始恢复，治疗完成后通常12个月之内恢复正常。在使用CD20治疗前以及治疗过程中动态监测B细胞的百分率，尤其是绝对计数的值。

低剂量的IL-2主要促进Treg细胞的分化和扩增。Treg细胞在维持免疫耐受、防止自身免疫和抑制炎症反应方面发挥着关键作用，指南推荐在使用低剂量IL-2的过程中，动态监测Treg细胞的量。治疗前以及治疗过程中动态监测Treg的百分率，尤其是绝对计数的值。治疗早期Treg细胞的数量越低，越有使用低剂量IL-2调节免疫治疗的价值，同时在治疗的过程中使用绝对计数较百分率更有指导价值。

3、治疗后疗效评估 《寻常型天疱疮诊断和治疗专家建议（2020）》中指出PV病情评估指标包括：

①临床评估指标：目前有多种评估体系，但以天疱疮疾病面积指数（pemphigus disease area index，PDAI）应用最多，是目前国际上公认的天疱疮病情评估方法。PDAI 0 ~ 8分为轻度，9 ~ 24分为中度，≥25分为重度。

此外，还有我国学者提出的按照皮损受累面积占体表面积（BSA）百分比的方法，及日本学者提出的天疱疮病情严重程度评分（JPDSS）。本案例中采用了PADI评分。

②实验室评估指标：对同一患者在治疗的不同阶段，抗Dsg抗体水平可作为病情评估指标。如果在治疗期间抗体水平上升，提示病情可能复发或加重，需密切随访。本案例中血清抗Dsg抗体定量分析提示，治疗后药物效应显著同时，PADI和抗Dsg抗体提示的治疗效应并不佳。因此注意，采用适宜指标评估相应的效应作用。

寻常型天疱疮（PV）是一组罕见的危及生命的自身免疫性皮肤病，主要表现为皮肤黏膜出现松弛性水疱、大疱、血疱，破溃后形成糜烂。其组织病理学特点是皮肤角质形成细胞和黏膜复层鳞状细胞间粘附功能丧失，引起表皮内水疱形成。以IgG为主的自身抗体和产生抗体的B细胞在天疱疮的发病机制中发挥关键作用。

桥粒是连接相邻角质形成细胞/复层鳞状上皮细胞，维持皮肤黏膜正常粘附功能的重要结构，自身抗体作用于桥粒的胞外结构域桥粒芯糖蛋白1和3，引起棘层松解和表皮内水疱形成^[1]。

PV的治疗一般首选糖皮质激素，在激素治疗无效或是效果不佳时考虑联合使用免疫抑制剂，如硫唑嘌呤、吗替麦考酚酯、环孢素、环磷酰胺等，对于一些难治性天疱疮患者，利妥昔单抗、血浆置换、免疫球蛋白冲击治疗等是有效的治疗方式^[1]。

使用利妥昔单抗的患者，12个月的完全缓解率达70~80%^[2]，24个月的长期完全缓解率达89%^[3]。然而，仍有部分难治性PV患者对多种治疗反应不佳或病情反复发作，对这部分患者免疫细胞亚群的分析以及持续监测有助于探索疾病活动、预测疾病预后、进一步指导该病的个体化精细治疗。

该患者使用了近一年多的CD20单抗治疗，外周血的B细胞也一直处于底限，然而抗体的水平却一直处于高线，我们需要分析是否抗体产生的浆细胞阶段没有得到很好地控制。这些自身的抗体主要是由B细胞发育、分化、活化转化成浆细胞，最后浆细胞再分泌出很多的自身抗体。

所以天疱疮患者的疾病活动度和浆母细胞以及短寿浆细胞分泌的抗体水平密切相关。B细胞在骨髓从Pro B细胞（祖B细胞）发育为Pre B细胞（前B细胞），部分前B细胞会进入外周，并发育成熟成为Naïve B（纯真B细胞）。

这些B细胞转移到淋巴结中，在抗原的刺激和T细胞的辅助作用下，成为活化的B细胞。有部分转变为记忆B细胞，保持在外周血中；有部分活化B细胞转变为分泌抗体的短寿命浆细胞，还有部分转变为浆母细胞，进而分化为长寿命浆细胞和浆细胞，归巢骨髓或者炎症组织持续分泌自身抗体。因为骨髓和炎症部位的浆细胞是不易检测的，所以外周血中的浆母细胞检测就变得很有意义了。

我们回顾该患者浆母细胞情况（如图4所示），发现该患者的外周浆母细胞明显升高，后期考虑使用针对浆细胞的CD38单抗辅助治疗，可能为该难治性天疱疮患者的治疗带来新机会。

我们报道了一例多种治疗病情仍反复发作的寻常型天疱疮（PV）患者，青年女性，23岁，我院确诊PV 3+年，既往曾先后使用用糖皮质激素、利妥昔单抗、丙种球蛋白冲击、甲氨蝶呤、盐酸米诺环素、羟氯喹、环孢素、硫唑嘌呤、吗替麦考酚酯、重组人白细胞介素-2、环磷酰胺冲击疗法、托法替布、度普利尤单抗等药物治疗，病情反复。

治疗过程中使用CD20单抗，效果不佳，B细胞数量的降低但并未出现自身抗体水平明显降低，且加之该患者胸部和头部皮肤损伤持续损伤，提示该难治性患者可能存在皮损部位的异位淋巴结构，局部B淋巴细胞活化促进自身抗体与皮损持续存在。此时自身抗体（抗桥粒芯糖蛋白1（Dsg1）和Dsg3抗体）监测可辅助评估PV患者治疗效果，而B淋巴细胞绝对计数仅反映药物效果，对于治疗效果评估作用有限。

值得注意的是，在生物治疗时代，外周免疫细胞监测是多种单抗治疗、生物治疗有效的药物效应评估手段，只有药物效应有效时，进一步评估治疗效果更有意义。

因此，本案例中临床采用利妥昔单抗或重组人IL-2治疗后均分别采用外周B细胞绝对计数和调节性T细胞的监测，有效的评估了药物效应。自身抗体定量有效评估了治疗效应。自身免疫性疾病，如天疱疮等的诊疗离不开自身抗体与外周免疫细胞的监测，浆母细胞的监测也可以为疾病疗效提供监测依据。为新的治疗选择提供思路和方向。

点评专家：李壹  四川大学华西医院实验医学科

自身免疫性疾病的的治疗已经从传统的免疫抑制剂的治疗向着精准靶向治疗的方向发展，目前临床有许多的靶向治疗药物，如靶向B细胞以及较多的细胞因子单抗，在精准免疫治疗的同时，精准的免疫监测必不可少，主要总结为以下几点：

1、免疫调节失衡的评估：通过对免疫细胞精细亚群的检测，可以评估免疫调节的失衡情况。在天疱疮中，可能存在精细亚群异常增加或减少的情况，进而影响免疫系统的稳定性，促进疾病的发展。

2、预测疾病的发展趋势：免疫细胞精细亚群的分析有助于预测天疱疮的发展趋势。某些特定的T细胞亚群异常可能与疾病的严重程度或预后相关，因此可以通过检测免疫细胞精细亚群分群来评估患者病情的进展和预后。

3、指导个体化治疗方案：根据精细亚群的分析结果，可以为天疱疮患者制定个体化的治疗方案。针对不同的免疫细胞精细亚群异常，可以选择相应的免疫调节治疗或免疫抑制剂，以达到最佳的治疗效果。

4、监测治疗效果：定期监测免疫细胞精细亚群分群的变化有助于评估治疗效果。通过跟踪T精细亚群的动态变化，可以及时调整治疗方案，确保患者获得最佳的治疗效果，减少并发症的发生。

参考文献

[1]Murrell DF, Peña S, Joly P, Marinovic B, Hashimoto T, Diaz LA, et al. Diagnosis and management of pemphigus: Recommendations of an international panel of experts. J Am Acad Dermatol. 2020 Mar;82(3):575-585.e1.

[2]P J, M MV, C PS, V H, E H, S C, et al. First-line rituximab combined with short-term prednisone versus prednisone alone for the treatment of pemphigus (Ritux 3): a prospective, multicentre, parallel-group, open-label randomised trial. Lancet (London, England) [Internet]. 2017 May 20 [cited 2023 Apr 24];389(10083). Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28342637/

[3] Werth VP, Joly P, Mimouni D, Maverakis E, Caux F, Lehane P, et al. Rituximab versus Mycophenolate Mofetil in Patients with Pemphigus Vulgaris. N Engl J Med. 2021 Jun 17;384(24):2295–305.

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