《NEJM医学前沿》周二【肿瘤深度观察】栏目就临床肿瘤学热点问题，梳理《新英格兰医学杂志》等顶级杂志近期论文，综述前沿进展，洞见未来方向。
过去十年中，基因测序技术广泛应用于癌症研究和临床实践中，成为揭示癌症分子特征的重要工具。分子诊断和靶向治疗进步促进了肿瘤精准治疗理念发展，为整个肿瘤诊疗领域带来了巨大变革。基因检测可用于癌症风险预警，指导治疗决策和评估预后，是改善患者临床结局重要工具。我们在此综合近期发表在CA Cancer J Clin、JCO、Ann Oncol等杂志文章，综述基因检测在癌症诊疗中应用。
体细胞突变和胚系突变。一般来说，癌症是由DNA突变导致的，这些突变既可以遗传自父母（胚系突变），也可以后天随年龄增长而发生（体细胞突变）。胚系突变从出生时就存在，突变者通常机体每个细胞的DNA中均携带突变，并且可继续传递给后代；体细胞突变是个体后天在非配子细胞中获得，通常不能遗传给后代。无论是胚系突变还是体细胞突变都可以破坏细胞的正常功能活性，导致细胞恶变。体细胞突变是恶性肿瘤的关键驱动因素，也是肿瘤学中最具预测价值的生物标志物，然而，大约10%~20%的肿瘤患者携带胚系突变，这些突变显著增加了其患癌风险，其中一些突变同样有治疗意义。
驱动突变和乘客突变。并非所有的DNA变异都会影响细胞功能，平均而言，5~10个基因组事件才能促发正常细胞恶变，这些事件也被叫做“驱动突变”。驱动突变往往发生在与细胞生命活动密切相关的基因中，如参与细胞生长调节、DNA修复、细胞周期控制等生命过程的基因，有作为治疗靶点的潜能。然而，任何癌症的突变总数都是相当庞大的，从一些乳腺癌的几千个突变到某些高变结直肠癌和子宫内膜癌中的超过十万个突变不等。大多数突变没有生物学意义或生物学意义有限，即使突变发生在编码区内，这类无关紧要的突变事件被称作“乘客突变”。如果基因变异在特定肿瘤类型中可以预测其对治疗的反应或耐药性，则认为该变异在临床上具有可操作性。
癌基因和抑癌基因。癌症中经常发生突变的基因大致可分为两类，癌基因和抑癌基因。在正常细胞中，癌基因编码的蛋白质主要发挥促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用，抑癌基因编码的蛋白则主要负责负调节细胞分裂以维持细胞正常功能。在恶性转化过程中，基因组突变导致癌基因活性增强，抑癌基因活性降低或丧失。
小变异和结构变异。这是基因组突变的两大主要类型。小变异通过改变、删除或增加少量碱基改变DNA，包括碱基插入、缺失、移码、起始密码子丢失、终止密码子丢失突变等。结构变异则是大的基因组重排，涉及的基因片段大小从几千个碱基到包含染色体的大部分不等，包括基因拷贝数改变，染色体缺失、重复、倒位或易位等。这些突变均可能会引起蛋白质功能的降低或增强。除了单个基因水平的变化，基因组签名（genomic signatures）也是临床测序报告的一部分。基因组签名可以看作小变异和（或）结构变异的复合模式，包括肿瘤突变负荷（TMB）、微卫星不稳定性（MSI）和同源重组缺陷。
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图1. 不同类别基因变异示意图
图A为小变异；图B染色体内结构变异；图C染色体间结构变异。
克隆突变和亚克隆突变。克隆突变存在于所有肿瘤细胞中，诊断时即存在，并在治疗进展后仍然存在。因此，克隆突变有用作肿瘤治疗靶点的潜能。亚克隆突变仅存在于一部分癌细胞中，也许能在诊断之初检测到，但在后续复发时消失或在仅在治疗后出现。癌症异质性是指单一癌症中存在多个亚克隆突变。值得注意的是，所有常见癌种中绝大多数有临床意义的驱动突变都是克隆突变，并且在癌症进展中保持稳定。而耐药性通常由亚克隆介导，在确诊时可能检测不到，但在治疗后复发时出现。
FISH或细胞核型用于检测染色体水平的改变。FISH可用于检测基因融合、缺失和扩增，并被认为是检测这类变异的“金标准”，其具有高准确度和灵敏度，但通量有限。在一些血液恶性肿瘤，尤其是急性白血病中，核型分析仍然被用来指导诊断和预后，但该技术逐渐被FISH、WGS和NGS等靶向分子检测所取代。单个基因的改变可通过PCR检测，包括实时PCR和数字液滴PCR。这类技术具有高灵敏度，尤其适用于检测和监测微小残留病灶，而且可在较短的时间内获取结果，其缺点在于检测范围有限（通常只能检测一个或几个基因中的突变），以及多重检测的能力有限。免疫组化（IHC）是一种基于蛋白质的监测手段，常用于检测生物标志物，如ERBB2（HER2）和雌激素受体的表达。IHC也可用于检测特定的突变蛋白（如BRAF V600E）和特定的基因融合（如ALK融合）。IHC的优点在于它能够轻松融入常规的组织分析流程，因此可以与其他测试相结合。此外，IHC可以提供关于亚细胞蛋白质定位的信息。缺点是可扩展性有限和对组织要求高。NGS 使用高通量并行测序技术来检测 DNA 和/或 RNA 水平上的变异。该技术既可以对全基因组进行测序（WGS）也可富集感兴趣的基因区域进行测序。通过WGS可以获得最全面的基因组突变信息，但其在临床上的推广面临着较多阻碍，包括需要新鲜的肿瘤组织样本（WGS尚不适合分析经福尔马林固定的样本）以及高昂的成本。靶向NGS测序包括全外显子测序和靶基因组合（gene panel）。这些检测通过DNA探针或PCR扩增来富集感兴趣的区域，从而限制所需的测序量（全外显子组占基因组的1%～2%，即使是包含500个基因的大型面板也仅占基因组的0.1%）。尽管全外显子测序在福尔马林固定的组织中表现良好，但其成本仍然较高。靶基因组合相对而言更加经济，并且可以灵活选择要检测的基因。此外，循环游离DNA（cfDNA）正成为癌症患者基因组分析的新选择，即所谓的液体活检。癌细胞和正常细胞都可向血液中释放DNA，从癌细胞脱落的DNA被称为循环肿瘤DNA（ctDNA），可用于分析检测肿瘤细胞中潜在的突变。取决于要解决的具体临床问题。大多数与批准疗法相关的生物标志物可通过FISH、IHC、PCR技术检测，这些方法在测定少量生物标志物时是合理的，但其不能随着通量的提高而提升检测效率，而且如果检测的生物标志物过多可能会导致没有足够的组织用于检测。在一些特殊癌种，如肺癌中，组织样本很难获得，而且有多种生物标志物需要检测，使用NGS是更好的选择。总之，检测方法的选择取决于每个患者需要检测的生物标志物数量以及需要进行生物标志物检测的患者数量。在某些情况下，使用IHC/FISH足矣，特别是当靶点已经明确时，如在乳腺癌患者中检测雌激素受体、孕酮受体和ERBB2。如果需要更全面地探查基因组突变和寻找潜在的治疗靶点，NGS更具组织和成本效益。此外，对于 IHC/FISH 结果模棱两可或不确定的情况，可以考虑 NGS。
不同的指南对于哪些患者适用于基因检测给出了指导意见。2020年，ESMO精准医学工作组发布了首部针对晚期癌症患者的NGS检测建议，推荐对晚期非鳞状非小细胞肺癌、前列腺癌、结直肠癌、胆管癌和卵巢癌肿瘤样本行常规NGS检测，2024年，ESMO在此基础上进行了更新，建议纳入乳腺癌和罕见肿瘤，如胃肠道间质瘤，肉瘤，甲状腺癌和原发灶不明癌。2022年，ASCO关于转移或晚期癌症患者体细胞基因组检测的临床意见中指出，如果有生物标志物相关的疗法在转移性或晚期实体瘤患者中获批，则推荐对这些患者进行基因检测。例如，应该在转移性黑色素瘤患者中进行基因组测试以筛选BRAF V600E 突变，因为RAF和MEK抑制剂已获批用于该适应证。此外，如果拟对患者应用的药物有明确的耐药标志物，也应当对患者进行基因检测。如EGFR单抗在KRAS突变型结直肠癌中无效。当考虑患者是否适用基因测序时，应当综合患者体能状态，合并症和肿瘤分期，因为基因组测序所需要的一系列步骤，包括患者同意，实验室处理和测序结果分析需要患者有足够的体能和预期寿命。除了体细胞突变外，某些癌症还应进行胚系基因检测。胚系突变检测可能会影响癌症的治疗决策，如乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌和胰腺癌中的BRCA1和BRCA2突变。胚系突变还可能对患者未来癌症的筛查和预防产生影响。潜在适合进行胚系突变检测的患者需要满足一定的条件，这些条件涉及癌症家族史、诊断年龄和癌症类型等因素。然而，许多携带胚系致病性变异的患者（多达50%）并不符合基于家族史的传统胚系突变检测标准。因此，为了最大化地识别突变携带者，美国国家综合癌症网络（NCCN）建议，所有或大部分乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、结直肠癌或前列腺癌患者都应接受胚系突变检测。关于进行基因检测的时间，因为绝大多数具有临床意义的驱动突变是克隆性的，在癌症进展过程中相对稳定，在诊断为晚期癌症时对患者进行基因检测是合理的。对于此后的基因检测，特别是在分子靶向治疗之后，ctDNA检测比肿瘤组织DNA更具优势，因为血液DNA可以包含来自所有肿瘤病灶的DNA，更有利于获取关于肿瘤异质性的信息。治疗后对ctDNA分析可能能够预测肿瘤对治疗的反应，并且比标准成像方法更早地确定疾病进展。然而，使用这些数据指导治疗决策的方案尚未建立，除非临床试验，否则不推荐使用ctDNA 分析。ctDNA也可用于肿瘤根治性手术后评估微小残留病灶，手术后ctDNA检测是随后疾病是否进展的有力预测因子，并且可能有助于确定患者能否从辅助化疗中获益，但目前仍不建议在临床试验外使用ctDNA指导辅助化疗决策。
基因组测序的第一步是从患者样本中提取DNA，制备文库，生成原始测序数据。原始数据还需要进一步处理，包括过滤低质量数据，与参考基因组进行比对，通过不同的分析算法确定不同类型的突变，确定这些突变对蛋白翻译的影响以及过滤胚系突变。旨在区分驱动突变和乘客突变。驱动突变导致抑癌基因活性丧失或癌基因活性增强。导致抑癌基因失活的小变异包括无义突变、移码突变和关键剪接位点突变以及较少发生的起始密码子缺失、终止密码子缺失以及大范围的内含子插入/缺失突变。此外，错义突变和小范围的内含子插入/缺失突变在影响重要功能结构域时，也可以导致肿瘤抑制基因活性丧失。导致肿瘤抑制基因活性丧失的结构变异包括部分或完全的基因缺失以及其他导致基因阅读框破坏的基因组变异。导致癌基因功能增强的小变异包括错义突变和偶尔的内含子插入/缺失，这些变异靶向重要的蛋白质功能结构域。在少数情况下，蛋白质截断或剪接位点突变可以导致癌基因的激活。导致癌基因激活的结构变异包括基因融合、基因缺失和基因重复。评估已鉴定突变的临床意义，即其潜在的诊断、预后或治疗价值。目前有多个循证分级系统可用于指导基因组变异的临床解读。美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心的精准医疗肿瘤数据库（OncoKB）将基因变异根据其对用药的预测价值分为4个级别：1/2级， FDA认可，或临床标准生物标志物，可预测特定适应证对已获批药物的反应；3级， FDA认可或不认可的生物标志物，可预测对在临床试验中显示出有希望的新型靶向药物的反应，4级，未被FDA认可的生物标志物，可预测在临床试验中显示出令人信服的生物学证据的新型靶向药物反应。后又增加了与治疗耐药性相关的第5个亚组。美国分子病理学会（AMP）/美国临床肿瘤学会（ASCO）/美国病理学家学会（CAP）联合制定的体细胞变异解读指南将体细胞变异分为4类：Ⅰ级，具有强临床意义 ；Ⅱ级，具有潜在临床意义；Ⅲ级，临床意义未知；Ⅳ级，已知无临床意义。只有Ⅰ级和Ⅱ级变异对治疗决策有价值。ESMO的分子靶点临床可操作性量表（ESCAT）将基因变异分为6个级别：Ⅰ级，适合常规使用的靶点；Ⅱ级，仍在研究中的靶点，很可能能用于筛选可从目标药物获益的患者群体，但需要更多数据支持；Ⅲ级，在其他癌种中证实有临床益处的靶标性基因变异；Ⅳ级，仅有临床前证据支持的靶标性基因变异；Ⅴ级，有证据支持靶向该突变有临床意义，但针对该靶点单药治疗并不会延长患者生存期，或可采取联合治疗策略；Ⅹ级，缺乏临床价值。
在使用NGS报告之前，应该对报告中所包含的数据进行初步的总体评估，以确保检测信息适合临床应用，可从以下几个方面分析一份NGS报告的质量。肿瘤组织是基因组分析的首选材料，这些组织可以通过活检、手术切除或细胞学取样获得。病理评估有助于确定肿瘤细胞的密度，一般而言，实体肿瘤活检样本约含有 30% 的肿瘤细胞。然而，某些癌种的肿瘤细胞密度较低，如胰腺癌，可能会影响基因测序的结果。如果未检测到驱动突变，可结合病理评估结果，考虑低肿瘤细胞密度的影响。当检测的小变异驱动突变，但变异等位基因分数（VAF）接近检测限时，则可能有其他驱动事件未被检测到，且可能会低估TMB等指标。肿瘤细胞密度较低的样本可通过宏观切除肿瘤区域等方式进行富集。另外，从NGS样本中评估基因拷贝数需要了解肿瘤细胞密度。确定根据权威指南，应当检测的生物标志物是否被纳入到NGS检测中非常关键，因为NGS panel在涵盖的基因数目和基因区域以及分析的基因组变异的类型（突变、拷贝数变化和重排/融合）方面差异差异很大。同时还需验证panel是根据DNA还是RNA测序检测融合基因也很重要，因为不同的核酸来源有不同的灵敏度。报告中应明确说明使用了商业检测试剂还是实验室开发的测试，并包括方法是否经过验证。VAF应该始终公开。VAF是体细胞突变的重要特征，代表携带突变的DNA分子占所有DNA分子的比例。VAF是三个因素综合作用的结果，即肿瘤细胞密度，突变克隆性和等位基因不平衡。大多数NGS panel有VAF报告限值，通常，肿瘤组织的阈值是5%，而ctDNA是0.1%。每个变异的VAF应该与肿瘤样本中的肿瘤细胞比例以及其他变异的VAF比较，以明确该变异是克隆性的还是亚克隆性的。在ctDNA中，鉴别出的VAF通常较低，因此很难确定其克隆性质。对于结构变异，如基因融合，无法准确计算VAF。根据ESMO精准医学工作组的建议，当在肿瘤样本中检测到潜在的致病性胚系变异时，应当使用既定的分类框架进行人工确认。潜在的胚系突变分为5类，包括致病、可能致病、意义不明、可能良性和良性。只有前两者在患癌风险预测、预防和治疗选择方面具有临床意义。在肿瘤样本中检测的胚系突变预期VAF在50%左右甚至更高，低VAF（碱基替换＜30%，插入/缺失突变＜20%）的变异不太可能是胚系变异。液体活检的应用日益广泛，来自ctDNA的数据分析遵循与肿瘤活检样本相同的基本原则，但存在一些差异。与肿瘤组织样本相比，ctDNA的局限性在于对驱动突变的检测敏感性降低。研究显示，ctDNA无法检测到20%～30%的突变，并且可能低估 TMB。这导致来源于ctDNA的阴性结果可能会有较高的错误率，因此如果ctDNA分析未能检测到驱动突变，应考虑组织活检。在解释ctDNA测序结果时应注意两个因素：VAF和克隆造血。除了受到等位基因失衡和突变克隆性的影响外，VAF还受到患者正常细胞释放的cfDNA的影响，当只有少量ctDNA进入血液循环，VAF会很低，通常<1%（取决于测定的灵敏度），但仍有可能是克隆突变。因此，治疗相关的生物标志物（如肺癌中的EGFR突变），即使VAF很低，也应该考虑临床可操作性。克隆造血代表健康个体中携带白血病相关驱动突变的造血细胞的扩增。克隆造血在老年人中常见，在癌症患者中，尤其是既往接受过化疗的患者中，其发生率似乎有所增加，因此血液DNA分析中经常检测到克隆造血突变。最常见的克隆性造血驱动突变出现在TET2和DNMT3A等基因中，这些基因在实体瘤中很少发生突变，因此可区分克隆性造血与肿瘤细胞突变。然而，克隆性造血也可能是由在实体瘤中也发生突变的基因(如TP53和ATM)中的突变所驱动的，这可能使ctDNA检测结果难以解读。
最后，需要根据基因组测序结果，结合患者的临床状况，个人病史和家族史为患者制定个性化的治疗方案。在制定临床决策时，应当考虑已经确定的基因变异的功能意义。临床医生不仅应该审查NGS报告中的基因变异列表，还应阅读功能注释模块的内容，了解特定变异对基因功能和治疗敏感性的影响。通过基因检测到的大多数突变是对癌症发展没有影响的乘客突变，只有一小部分是驱动突变。某些驱动突变可以用作预测靶向治疗疗效的生物标志物。大多有治疗潜力的生物标志物通过直接（在癌基因的激酶结构域内发生突变或与其他基因的部分融合）或间接（抑癌基因失活导致激酶功能失调）机制激活激酶，而其针对性的靶向药物通常是特异性的激酶抑制剂。另一些具有临床可操作性的基因是抑癌基因，其失活或删除突变可能导致癌细胞发生某些变化，产生可以被药物针对的靶点。例如，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）抑制剂在BRCA突变癌症中通过“合成致死”机制发挥作用，即当PARP活性被抑制并且BRCA功能丧失时，联合效应导致癌细胞死亡。精准肿瘤学的一大挑战在于如何确定特定的基因变异是乘客突变，可靶向治疗的驱动突变还是不可靶向治疗的驱动突变。在可靶向治疗的基因变异中，并非所有变异都有针对性的药物可用。一些药物的批准是基于仅在携带特定基因变异的肿瘤患者中进行的临床研究，如BRAF抑制剂维罗非尼和达拉非尼在多种适应证中都明确规定了仅适用于携带BRAF V600E突变，而非BRAF基因内的其他变异。同一基因的不同突变的药物敏感性可能存在差异。例如，尽管黑色素瘤中BRAF V600E被证明对维罗非尼和达拉非尼敏感，但BRAF K601E却对这些药物具有耐药性。某些药物具有适应证范围较广。例如，奥拉帕利获批用于携带BRCA1或BRCA2有害或疑似有害的胚系突变的乳腺癌患者；厄达替尼获批用于携带易感FGFR2和FGFR3基因变异的尿路上皮癌（详见《从ASCO到ESMO，免疫治疗失败的尿路上皮癌研究终于登上NEJM》）。在这些例子中，临床医生必须确信所识别的基因变异是有害、疑似有害的或易感的，然后才能推荐相应的治疗。在这种情况下，使用已收集关于特定基因中不同突变功能意义的信息知识库，成为重要的临床决策支持工具。这些知识库帮助医生了解不同突变的功能影响，从而做出更明智的治疗决策。
参考文献
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