Food Chem. X | 中国农业大学尚楠副教授:鲟鱼片脂质转化的分子机制:特定腐败与优势细菌之间的相互作用

学术   2024-11-10 08:02   福建  
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Abstract

本研究利用基于UHPLC-QOrbitrap-MS/MS的非靶向脂质组学分析研究了腐败细菌对鲟鱼片脂质代谢的影响。共鉴定出5个类和42个亚类的4041个脂质分子,包括甘油磷脂(GP,50.88%)、甘油脂(GL,36.08%)、鞘脂(SP,10.47%)、脂肪酰(FA,2.45%)和甾醇脂质(ST,0.12%)。温和气单胞菌是一种特定的腐败细菌,通过胞外脂肪酶和酯酶减少GP和FA,同时增加GL、SP和ST。不动杆菌是优势菌,主要升高SP和FA。它们的相互作用促进脂质代谢和氧化,同时产生挥发性有机化合物(VOC)。异丁酸乙酯、丙酸乙酯、甲酸异丁酯、戊-2-酮、丙-2-酮、2-丁酮、3-甲基-3-丁烯-1-醇和二甲基硫醚主要与不动杆菌有关,而1-己醇、1-戊醇、1-戊烯-3-醇、1-羟基丙-2-酮、3-甲基-1-丁醇、2-甲基丁醛、3-羟基-2-丁酮和丙醛主要与温和气单胞菌有关。该工作揭示了鲟鱼片冷藏过程中脂质转化的机制,为水产品质量控制提供了见解。

Introduction

鲟鱼是中国重要的水产品,脂肪含量高,富含不饱和脂肪酸(UFA),在储存过程中会发生脂质转化,显著影响消费者的偏好。目前对各种水产品的研究,强调了内源酶作用和微生物活动在脂质代谢中的作用。与内源性脂肪酶相比,微生物可以产生各种类型的脂肪分解酶(例如酸性脂肪酶、中性脂肪酶、磷脂酶和酯酶)和脂氧合酶。这些脂肪酶可以作用于甘油三酯(TG)和磷脂(PL)产生游离脂肪酸(FFA),并促进UFA形成脂肪酰基氢过氧化物、醛类和羰基物质,从而影响肉的挥发性风味成分。此外,这些外源脂肪酶还可以通过酶促反应在一定程度上加速脂质氧化。在脂氧合酶的作用下,鲟鱼制品中的亚油酸和花生四烯酸等不饱和脂肪酸可转化为氧化物,从而改变脂质过氧化值(POV)和硫代巴比妥酸反应物质(TBARS),从而导致鱼肉品质的下降。
 
近年来,基于液相色谱和质谱的脂质组学已广泛应用于动物食品研究,为表征脂质代谢调节的分子机制提供了新的工具。在鲟鱼片中识别出具有产生脂肪酶和降解脂质的能力的温和气单胞菌和不动杆菌两种优势细菌,结合理化指标和超高效液相色谱-高分辨质谱(UHPLC-Q-Orbitrap MS/MS)探讨了冷藏过程中腐败微生物引起的鲟鱼片的生化变化和包括质量特征、脂质降解、外源脂肪酶活性和脂质代谢在内的脂质谱,并使用气相色谱-离子迁移谱(GC-IMS)分析鱼片中脂质分解和氧化相关的挥发性有机化合物(VOC)的变化,为获得的全面洞察为未来鲟鱼产品的精确质量控制奠定了基础。

Results and Discussion

微生物的生长和TVB-N的变化
微生物生长结果表明,鱼片的无菌加工是成功的,且在冷藏过程中没有受到污染。整个冷藏期间,经过无菌处理的鱼片细菌计数始终低于2.0(lg(CFU/g))。每个接种组的初始细菌计数分别为3.5、3.5和3.7(lg(CFU/g)),接近新鲜鱼片的初始微生物水平4.0(lg(CFU/g))。随着冷藏时间的延长,细菌数量显著增加(P<0.05),尤其是在冷藏初期。不动杆菌的繁殖速度明显高于温和气单胞菌,且温和气单胞菌与不动杆菌的共存显著促进了后期微生物数量的增加。最终,共培养组的细菌计数达到了9.7(lg(CFU/g)),显著高于单独接种温和气单胞菌和单独接种不动杆菌。

鲟鱼片中腐败菌的生长直接影响TVB-N含量的变化,如图1A所示。贮藏初期,各处理组鲟鱼片TVB-N含量未见显著变化,表明TVB-N的生成需要微生物繁殖到一定数量。最终,温和气单胞菌接种组的TVB-N含量显著增加(P<0.05),达到了22.62 mg/100 g,在冷藏第12天时明显升高,显示出温和气单胞菌在产生腐败代谢物方面具有较高能力。然而,从温和气单胞菌和不动杆菌共培养组的结果来看,不动杆菌的添加并未增加TVB-N产量,反而降低了TVB-N含量,表明不动杆菌在蛋白质降解过程中产生腐败代谢物的能力较低。

图1  4 C冷藏期间不同接种组的鲟鱼片挥发性碱基氮总量(A)、游离脂肪酸含量(B)、TBARS值(C)、POV值(D)、脂肪酶活性(E)、酯酶活性(F)的变化

游离脂肪酸的变化
不同接种组的鲟鱼片游离脂肪酸含量变化如图1B所示。对照组和温和气单胞菌接种组的游离脂肪酸含量随着储存时间的延长而逐渐增加,分别从初始含量的1.9 μmol/g上升到冷藏期结束时的2.6和3.2 μmol/g。不动杆菌接种组温和气单胞菌和不动杆菌共培养组,冷藏前6 d游离脂肪酸含量显著增加(P<0.05),达到3.1 μmol/g和3.5 μmol/g然后逐渐减小。游离脂肪酸首先从脂质中释放出来,然后被微生物进一步利用和氧化。结果表明,冷藏末期优势菌不动杆菌具有较强的降解脂质和利用脂肪酸的能力。这与之前的腐败代谢组结果一致,并进一步证明不动杆菌确实影响鲟鱼片的脂质代谢。

TBARSPOV值的变化
鲟鱼片在有氧贮藏过程中容易发生脂质氧化,脂质氧化的初级产物和中间产物可以用常用指标TBARS和POV来表征。如图1C和D所示,接种组的TBARS值和POV值随贮藏时间的延长显著增加(P<0.05)且高于对照组,表明鲟鱼片中的优势菌显著促进脂氧化。贮藏初期共培养组的TBARS值高于单独接种组,但在培养后期低于不动杆菌单独接种组。

这可能是因为不动杆菌在储存结束时可以产生更多用于脂质氧化的关键酶,例如脂氧合酶。POV值的变化也表明,不动杆菌接种组在储存期结束时比其他接种组经历了更严重的氧化,这种氧化可能与微生物通过代谢产生脂肪酶有关。但制冷后期POV的增加幅度大于TBARS,可能是因为氢过氧化物的分解速度比其生成速度慢,醛类等不稳定的二次氧化产物被进一步氧化或降解形成低分子量的产物。长期冷藏过程中的挥发性有机化合物。

鱼肉中脂质的代谢主要归因于内源酶和微生物活动,微生物可以产生多种脂肪分解酶来水解脂质。例如,微生物脂肪酶可以作用于甘油三酯和磷脂,产生游离脂肪酸并促进饱和脂肪酸形成脂肪酰基氢过氧化物、醛和羰基物质。为了验证脂肪酸的变化是否与微生物分泌的脂肪分解酶有关,测量了脂肪酶和酯酶活性。如图1E所示,温和气单胞菌和不动杆菌均具有较强的产脂肪酶能力,其接种组鱼片的脂肪酶活性随冷藏过程时间的延长而显著增加(P<0.05),且不动杆菌的脂肪酶产生能力强于不动杆菌。

微生物分泌酯酶的能力如图1F所示,其中不动杆菌和温和气单胞菌同样表现出较高的分泌胞外酯酶的能力。与仅接种特定腐败菌温和气单胞菌相比,添加优势菌不动杆菌显著提高了酯酶活性(P<0.05)。这可能是共培养组中差异脂肪酸种类比单一接种组更多的原因。在微生物胞外脂肪酶和酯酶的作用下,脂质被水解,导致脂肪酸含量增加。脂肪酶和酯酶活性的变化可以很好地反映脂质代谢水平,因为它们具有多种催化能力,也可以用来表达磷脂酶、胆固醇酯酶、酰胺酶等的活性。

脂质代谢分析
冷藏鲟鱼片中的脂质
排除RSD>30%的离子特征,在ESI+和ESI-模式下,样品中总共鉴定出4041个脂质分子,分为甘油磷脂(GPs)、甘油脂(GLs)、鞘脂(SPs)、脂肪酰类(FAs)和甾醇脂质(STs)(图2A)。其中,检出甘油三酯(TG)934种,占总脂质的23.11%,其次是磷脂酰胆碱(PC)541种(13.38%)、二酰甘油(DG)475种(11.75%)、磷脂酰乙醇胺(PE)441种(10.91%)。

图2  鲟鱼片中鉴定出的脂质亚类和类别(A)以及不同接种组样品中脂质亚类和类别的百分比(B)

样品中主要脂质成分及含量分布如图2B所示。不同处理组中所占比例最大的是TG,微生物的存在显著影响脂质组成。

鲟鱼片样品的多元统计分析
OPLS-DA评分图显示,各组比较样本分离明显,同一组样本聚集性良好(图3A、C、E、G)。OPLS-DA模型的交互验证主要体现模型的X变量和Y变量(R2XR2Y)的可解释性,以及模型的可预测程度(Q2)。As12与C12的R2YQ2值分别为0.92和0.93(图3B),而其他三对的R2Y和Q2值分别为0.90~0.97(图3D、F和H)。这些结果表明模型没有过拟合,数据具有较高的可靠性和预测能力。因此,PCA和OPLS-DA模型均表明接种组和对照组之间存在显著差异,冷藏期间鲟鱼片中脂质的变化受到微生物组成的影响。

图3  As和C(A-B)、Aa和C(C-D)、AsAa和C(E-F)、Aa和As(G-H)的OPLS-DA评分图和替代检验图

鲟鱼片冷藏过程中脂质的变化
鱼片样品中鉴定出的脂质由五个亚类组成,其含量变化如图4A所示。与对照组相比,温和气单胞菌接种组甘油磷脂和脂肪酰的含量减少,而甘油脂、鞘脂和甾醇脂质的含量增加;不动杆菌接种组显著增加了鞘脂和脂肪酰的含量,而共培养组则增加了鞘脂和甾醇脂质的含量。

图4  不同接种组的鲟鱼片在冷藏过程中脂质亚纲(A)和纲水平显著不同类别(B)的变化

进一步分析脂质亚类,检测到42个类别,其中有18个类别存在显著差异变化,如图4B所示。与对照组相比,温和气单胞菌接种组中水平升高的类别有糖基神经酰胺系列(包括CerG3GNAc1、Hex2Cer和Hex3Cer)、磷酸神经酰胺(CerP)、胆固醇酯(ChE)、辅因子(Co)、神经节苷脂(GD1a)、磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)、鞘磷脂(SM)、鞘磷脂(SPH)、磷酸鞘氨醇(SPHP)和蜡酯(WE),递减类别为甘油二酯(DG)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、单甘油酯(MG)和酵母甾醇酯(ZyE)。不动杆菌接种组和共培养组的类别表明,不动杆菌和温和气单胞菌表现出相似的脂质代谢特性,但它们转化不同脂质的能力不同。与温和气单胞相比,不动杆菌生产CerP、Co、GD1a、PE和SPH的能力较强,而生产ChE、Hex2Cer、Hex3Cer、PA、PI和SPHP的能力较差,而利用DG的能力较强。这些结果表明,鲟鱼片中的微生物在冷藏过程中主要利用DG、LPC和MG将其转化为其他亚类,并且温和气单胞菌和不动杆菌表现出很强的脂质代谢能力。

脂肪酸组成
此外,样品中这些显著不同的脂肪酸(VIP>1,P<0.05)用于进行层次聚类分析(图5A)。表明同一接种组样品之间的脂肪酸代谢过程较为接近,而不同接种组之间,尤其是对照组和共培养组之间存在较大差异。腐败菌显著改变了鲟鱼片中长链脂肪酸的组成此外,冷藏后鱼样品中的饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)增加(图5B)。对于对照组、温和气单胞菌接种组、不动杆菌接种组和共同接种组的样品,SFA从第0天的7.07 mg/g增加到第12天的10.23、12.29、11.15和14.47 mg/g。

根据样品中检测到的显著不同的脂肪酸分子与KEGG通路之间的关系,示意性地绘制了脂肪酸代谢网络(图5C)。腐败微生物的脂肪酸代谢涉及脂肪酸的合成、降解和链延长。鱼片中的脂质被内源酶和微生物酶水解成游离脂肪酸,进一步代谢氧化生成乙酰辅酶A,并在相关合成酶的作用下参与一系列脂肪酸的生产。脂肪酸代谢的中间产物棕榈酸和棕榈酰辅酶A与甘油酯代谢、甘油磷脂代谢和脂肪酸链延长有关,进而产生棕榈酸甲酯和棕榈酰辅酶A(图5C)。鱼片中不饱和脂肪酸的代谢也受到腐败微生物的影响,如亚油酸代谢和卵磷脂代谢产生花生四烯酸。

图5  不同接种组鲟鱼片在4 ℃冷藏期间的差异脂肪酸聚类热图(A)、不同脂肪酸含量变化(B)以及差异脂肪酸涉及的KEGG代谢途径(C)

鲟鱼片的脂质代谢途径
选择具有显著差异的脂质分子进行KEGG通路分析,并结合已确定的中间体示意性地绘制了脂质转化的潜在途径(图6)。相关代谢途径主要涉及甘油磷脂代谢、甘油酯代谢、亚油酸等脂肪酸代谢、甾醇脂质生物合成。据报道,胆固醇生物合成受细胞色素P450芳香酶、胆固醇侧链裂解酶和17α-羟化酶/裂解酶的影响。将长链脂肪酰基从DG转移到胆固醇,同时释放1-酰基甘油的微生物甘油磷脂在细胞组成和代谢调节中发挥着关键作用。结果表明,PE、PA、PC、LPC和PI是与鲟鱼片中甘油磷脂代谢途径相关的主要脂质。PC和LPC通过酶的作用相互转化(图5),磷脂酶A2分解PC分子产生LPC(207),LPC和乙酰辅酶A在溶血磷脂酰基转移酶的作用下可以形成PC。CDP-DG是磷脂合成的主要前体,在鱼片的脂质转化过程中也起着至关重要的作用,CDP-DG可以通过CDP-DG合酶将PA转化为PC、PI、PG和心磷脂。PA是细胞膜甘油磷脂合成途径中的关键中间代谢产物,参与多种细胞过程,它可以由多种类型的脂肪分解酶(例如磷脂酶、脂质酶)产生和代谢。激酶和磷酸酶)。冷藏过程中PA含量增加主要是微生物利用其他物质合成自身细胞膜进行繁殖造成的。

TG和DG是冷藏鲟鱼鱼片中鉴定的主要脂质,与甘油酯代谢途径有关,其中DG可由磷脂酶c催化PE和PC水解合成,并由PA、TG、MG和CDP-DG转化。在相应磷酸转移酶存在的情况下,DG还可以充当PE和PC合成的脂质锚。本研究结果表明,在微生物酶的作用下,鱼片中DG含量下降,TG含量增加,且DG向TG产生方向发生转化。TG主要是通过二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)催化DG与脂肪酰辅酶A共价结合形成的。其中,DGAT1优先酯化预先形成的FA,负责富含TG的极低密度脂蛋白颗粒的组装和分泌,而DGAT2则酯化FA合成TG。此外,鱼片中的脂质被微生物胞外酶分解,产生游离脂肪酸,在冷藏过程中进一步进行脂肪酸代谢和氧化。这是由于脂肪分解酶和脂氧合酶的作用。当鱼肉中脂质的氧化产物浓度达到一定水平时,它们开始分解,形成烷氧基,然后通过不同的途径形成碳氢化合物、醇、醛、酸等化合物。综上所述,鲟鱼片在冷藏过程中发生了显著的脂质变化,这种变化与多种代谢途径和多种酶有关。然而,特定相关酶在冷藏鱼片中的作用还需要进一步研究。

图6  冷藏期间腐败细菌诱导的鲟鱼片脂质转化的潜在途径

挥发性有机化合物分析
挥发物等高线图如图7A所示,样品中VOCs分布的斑强度反映了化合物在贮存过程中的变化。

图7  在 4◦C 储存期间,第0、6和12天时,不同接种鱼片中鉴定出的VOC

储存期间的化合物。鱼片中的挥发物随着储存时间的增加而增加。鱼片在冷藏过程中VOCs的产生主要是由于其自身物质的降解和微生物的代谢。VOCs比较指纹图谱分析如图7B所示,接种特定腐败菌温和气单胞菌和优势菌不动杆菌均增加了大量VOCs。冷藏第6天,1-己醇、1-戊醇、1-戊烯-3-醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-3-甲基噻吩、1-羟基丙-2-酮等VOCs、温和气单胞菌接种组和共培养组中2-甲基丁醛和3-羟基-2-丁酮显著增加;异丁酸乙酯、甲酸异丁酯、丙酸乙酯、2-庚烷、2-戊烷、2-丙烷、3-甲基-3-丁烯-1-醇、二甲硫醚等VOCs在A区显著增加。然而,诸如乙酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸甲酯、1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、丁醇、2-乙酰吡嗪和(E)-2-己烯醛等VOC仅在共培养组中显著增加。结果表明,共培养组对挥发性成分的影响大于单一接种组,其中异丁酸乙酯、丙酸乙酯、甲酸异丁酯、2-戊烷、2-丙烷、2-丁酮等VOCs、3-甲基-3-丁烯-1-醇和二甲基硫醚主要与不动杆菌有关,而1-己醇、1-戊醇、1-戊烯-3-醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-3-甲基噻呋喃、1-羟基丙-2-酮、2-甲基丁醛、3-羟基-2-丁酮和丙醛主要与温和气单胞菌有关。微生物相互作用显著影响挥发物的组成和含量,例如乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸甲酯、1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、丁醇、2-乙酰吡嗪、(E)-2-己烯醛。戊烷-2-酮和庚烷-2-酮可能是由鱼片氧化形成的,因为它们通常在高氧包装肉中产生。

Conclusion

本实验研究了冷藏过程中鲟鱼片腐败与优势细菌之间相互作用的生化变化和脂质代谢特征。温和气单胞菌通过细胞外脂肪酶和酯酶作用,减少脂肪酰基和甘油磷脂,同时增加甘油脂、鞘脂和甾醇类脂质。不动杆菌则主要升高鞘脂和脂肪酰基水平。鲟鱼片中的腐败菌主要利用DG、LPC和MG脂质,将其转化为PE、PS、TG、PA等脂质类别。不动杆菌表现出比温和气单胞菌更强的细胞外脂肪酶和酯酶生产能力,进一步促进了脂质代谢和氧化。脂质代谢途径主要涉及甘油磷脂代谢、甘油酯代谢及亚油酸等脂肪酸的代谢,并伴随挥发性有机化合物(VOCs)的产生。微生物相互作用显著影响挥发性有机化合物的组成和含量,导致酮类、醛类和含硫化合物的生成,从而使冷藏鲟鱼片产生异味。然而,还需要进一步研究,以调查相关微生物酶在鲟鱼片储存期间对脂质谱的确切作用。


Insights into the molecular mechanisms of lipid transformation in sturgeon fillets: Interplay between specific spoilage and dominant bacteria

Chunming Tana,c, Shiqi Zhanga, Fanglei Zoub, Boya Gaoa, Yujin Lid, Pinglan Lia,*, Nan Shangb,*

a Beijing Laboratory for Food Quality and Safety, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China

b College of Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China

c National R&D Center for Freshwater Fish Processing, College of Life Sciences, Jiangxi Normal University, Nanchang, Jiangxi 330022, China

d College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao, Shandong 266003, China

*Corresponding author.


Abstract

This study investigates spoilage bacteria's impact on lipid metabolism in sturgeon fillets using UHPLC-Q-Orbitrap-MS/MS-based untargeted lipidomic analysis. A total of 4041 lipid molecules across five classes and 42 subclasses were identified, including glycerophospholipids (GPs, 50.88%), glycerolipids (GLs, 36.08%), sphingolipids (SPs, 10.47%), fatty acyls (FAs, 2.45%), and sterol lipids (STs, 0.12%). Aeromonas sobria, a specific spoilage bacterium, reduced GPs and FAs while increasing GLs, SPs, and STs via extracellular lipases and esterases. Acinetobacter albensis, the dominant bacterium, mainly elevated SPs and FAs. Their interaction promoted lipid metabolism and oxidation while producing volatile organic compounds (VOCs). Ethyl isobutyrate, ethyl propionate, isobutyl formate, pentan-2-one, propan-2-one, 2-butanone, 3-methyl-3-buten-1-ol, and dimethyl sulfide were mainly associated with Acinetobacter albensis, while 1-hexanol, 1-pentanol, 1-penten-3-ol, 1-hydroxypropan-2-one, 3-methyl-1-butanol, 2-methylbutanal, 3-hydroxy-2-butanone, and propionaldehyde were mainly related to Aeromonas sobria. This work unveils the mechanism of lipid transformation in sturgeon fillets during refrigerated storage, offering insights for aquatic products quality control. 

Reference:

TAN C, ZHANG S Q, ZOU F L, et al. Insights into the molecular mechanisms of lipid transformation in sturgeon fillets: Interplay between specific spoilage and dominant bacteria[J]. Food Chemistry: X, 2024, 23, 101714. DOI:10.1016/j.fochx.2024.101714.

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翻译:王诗语 (实习)
编辑:梁安琪;责任编辑:孙勇
封面图片来源:图虫创意

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