河南大学国家食用菌加工技术研发专业中心在红花膳食纤维调节功能性便秘研究方面取得进展

成果介绍

Introduction

红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花，富含黄酮、酚类、生物碱、多糖等生物活性成分，对神经退行性疾病、心血管和呼吸系统疾病具有一定的治疗效果。红花不溶性膳食纤维为红花提取红色素后的副产物，未见其活性报道。本文通过碱提取法从红花中提取不溶性膳食纤维（SDF），用 LOP 建立便秘大鼠模型。通过检测胃动素 （MTL） 和胃泌素 （GAS）、P 物质 （SP）、生长抑素 （SS）、血管活性肠肽 （VIP） 等生化指标、组织学变化和肠道菌群变化，探讨 SDF 对大鼠便秘的缓解作用。

Results and Discussion

1. SDF 的理化性质和结构表征

SDF的持水量、持油量和溶胀量分别为 6.35 g/g、1.60 g/g 和 5.30 mL/g（图1a）。纤维素、半纤维素和木质素的含量分别为29.48%、7.12%和27.28%（图1b）。其单糖组成为：32.80% 葡萄糖 （Glc）、16.44% 半乳糖 （Gal）、18.20% 阿拉伯糖 （Ara）、18.12% 木糖 （Xyl）、7.16% 鼠李糖 （Rha）、3.82% 半乳糖醛酸 （GalA）、1.39% 甘露糖 （Man）、1.18% 岩藻糖 （Fuc） 和 0.87% 葡萄糖醛酸 （GlcA）（图1c）。

Fig. 1. Physical and chemical properties of SDF (a). The basic components of SDF (b). Monosaccharide composition of SDF(c). Infrared spectrogram of SDF(d). SEM image of SDF (2000 × ) (e). SEM image of SDF (5000 × ) (f).

IR图显示（图 1d ），SDF 在 3427 cm−1的波长处具有较宽的吸收峰，为纤维素和半纤维素中通常存在的 OH 键的拉伸振动吸收峰，2912 cm-1处的 C-H 键的伸缩振动吸收峰，为甲基多糖的特征吸收峰。1637 cm-1的吸收峰为羰基或醛基 C=O 非对称收缩振动形成，而 1400 cm−1处的小吸收峰通常表明木质素中存在芳香族苯基团。1040 cm–1的吸收峰归因于半纤维素和木质素中的 C-O 键伸缩振动，这是糖类的典型特征吸收峰。

SDF 在 2000×和 5000×放大倍率下的 SEM 显微照片显示SDF呈松散、不规则和多孔状结构（图 1e 和 1f ）。

2. SDF 对功能性便秘的调节作用

2.1 SDF 对便秘大鼠粪便含水量、排便频率和小肠推进率的影响

与 Con 组相比，LOP 组在 6 小时内粪便含水量和排便频率均表现出显着降低。与 LOP 组相比，SDF 组便秘大鼠的粪便含水量和排便频率均表现出显着增强（图 2a 和 2b），SDF 组的肠道推进速率比 LOP 组明显恢复 （P < 0.05）（图 2c）。

Fig. 2. Effects of SDF on the defecation status and Serum gastrointestinal active peptide levels. 6-h defecation frequency (a). Water content (b). The small intestinal propulsive rate (c). Motilin (MTL) (d). Gastrin (GAS) (e). Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) (f). Substance P (SP) (g). Somatostatin (SS) (h). Values are expressed as means ± SD. Compared with the LOP group, ***P < 0.001，**P < 0.01，*P < 0.05; Compared with the Con group, ###P < 0.001，##P < 0.01，#P < 0.05.

2.2 对便秘大鼠血清中胃肠激素的影响

与 Con 组比较，LOP组便秘大鼠血清中 MTL、GAS 和 SP 的水平显著降低，而 SDF 高、中、低剂量组均能够升高便秘大鼠血清中 MTL、GAS 和 SP 的水平。其中，中剂量组便秘大鼠血清中的MTL 水平有升高的趋势，未表现出显著性。LOP 组便秘大鼠血清中 SS 和 VIP 的水平较 Con 组均有显著升高。这表明 LOP 抑制了肠道的蠕动能力，导致肠道转运能力降低，引起便秘。SDF 补充后，与 LOP 组相比，SS 水平被显著降低，VIP 水平也呈现降低的趋势（图2d、2e和2h）。

2.3 SDF 对肠道组织的影响

从图 3a 中可以看出 Con 组结肠上皮完整，粘膜层上皮规则，杯状细胞形态正常。在 LOP 组中，结肠绒毛排列松散，隐窝缩短。补充 SDF 后，结肠绒毛恢复正常，隐窝表现出比 LOP 组更好的分离状态。LOP组的小肠组织显示局部细胞浸润，隐窝的边界消失。补充 SDF 使小肠组织的隐窝明显（图 3b），表明SDF 可以保护这些组织的结构完整性并减轻便秘对肠道屏障的损害。

Fig. 3. Effects of SDF on intestinal morphology and SCFAs. Observation of colon tissue by H&E staining (a). Observation of small intestine tissue by H&E staining (b). Acetic acid (c). Propionic acid(d). Butyric acid (e). Values are expressed as means ± SD. Compared with the LOP group, ***P < 0.001，**P < 0.01，*P < 0.05; Compared with the Con group, ###P < 0.001.

2.3 SDF 对 SCFA 的影响

从图 3c、3d 和 3e 可以看出，与 Con 组比较，LOP 组丙酸和丁酸的水平显著降低，SDF 干预升高了丙酸和丁酸的水平。

2.4. SDF 对肠道菌群的影响

在图 4a 中，Con 组的 Chao 1 指数和 Shannon 指数分别为 892.49 和 4.46。与 Con 组相比，LOP 组的 Chao1 指数和 Shannon 指数分别降至 860.96 和 4.1，结果表明便秘大鼠肠道菌群的丰富度和多样性受到影响，呈下降趋势。补充 SDF 后，与 LOP 组相比，便秘大鼠微生物菌群的丰度和多样性在不同程度上恢复，表明 SDF 能够控制大鼠肠道菌群的物种丰度和多样性。如图 4b 所示，补充 SDF 逆转了便秘引起的β多样性下降，表明对便秘大鼠肠道微生物群多样性有有益影响。同样，在图 4b 和 d 中，LOP 组与 Con 组表现出明显的距离，而不同剂量的 SDF 成分聚集在 Con 组周围，表明距离更近。这表明补充 SDF 有助于增强便秘大鼠肠道微生物群的多样性。α 和 β 多样性分析表明，SDF 通过调节肠道微生物群的丰度和多样性来缓解便秘。

在图 4e 中，厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和疣微菌门是门水平的优势种群，合计约占总菌群的 95%。与 Con 组相比，LOP 组发现拟杆菌门、疣微菌门和变形菌门的相对丰度较高，而厚壁菌门的相对丰度较低。补充 SDF 导致变形菌门和拟杆菌门的相对丰度降低，厚壁菌门丰度升高，并最终恢复了便秘大鼠被破坏的肠道菌群平衡。此外，在图 4f 中，观察到 LOP 组与 Con 组匹配时 F/B 比降低。补充 SDF 能够恢复便秘大鼠肠道微生物群中这种降低的 F/B 比率。

在属水平上对主要肠道微生物群物种分析表明（图 4g），与 Con 组相比，LOP 组显示 Oscillopira、Prevotella 和 Treponema 的比例增加，瘤胃球菌属、Coprococcus、Akkermansia、梭状芽胞杆菌属、Roseburia 和乳酸菌属的相对分布下降。给予SDF 后Prevotella 和 Treponema 的相对丰度有所下降，瘤胃球菌、Coprococcus、Akkermansia 和 Clostridium 的相对丰度有所升高。根据 KEGG 数据库统计代谢通路分析，肠道菌群的功能主要集中在氨基酸代谢、其他次生代谢产物的生物合成、碳水化合物代谢、细胞生长和死亡、细胞运动、消化系统、内分泌系统、能量代谢、排泄系统和聚糖生物合成等方面（图 4h）。

Fig. 4. Effects of SDF on gut microbiota. α diversity index (a). β diversity box diagram (b). Principal component analysis (c). Principal coordinate analysis(d). Relative abundance of dominant flora at phylum level(e). F/B value(f). Comparison of key differential flora at the genus level (g). KEGG function prediction of gut microbiota (h). The data is presented in the form of means ± SD. Compared with the LOP group, ***P < 0.001，**P < 0.01，*P < 0.05; Compared with the Con group, ###P < 0.001.

2.5. SDF 对代谢物的影响

采用 LC-MS/MS 技术对 Con 组、LOP 组和 SDF 高剂量组盲肠内容物进行非靶向代谢组学分析。PCA 结果显示三个样品组之间有明显的分离，表明代谢物组成存在显著差异。PLS-DA 分析表明 LOP 组和 Con 组以及 SDF-H 组和 LOP 组的比较之间存在明显的分离。OPLS-DA 的结果显示三个样品组之间存在显著分离（Con vs LOP，R2Y = 0.969，Q2 = 0.728;SDF-H 与 LOP，R2Y = 0.991，Q2 = 0.62），这进一步验证了三组之间的代谢物组成显著不同，数据样品表现出稳定性和可靠性（图5a-5e）。

Fig. 5. Statistical analysis of metabolites. PCA atlas analysis (a). PLS-DA atlas analysis between Con and LOP group (b). PLS-DA atlas analysis between LOP and SDF-

H group (c). OPLS-DA atlas analysis between Con and LOP group (d). OPLS-DA atlas analysis between LOP and SDF-H group (e).

在 OPLS-DA 模型 （VIP ≥1，倍数变化 ≥1.2 或 ≤ 0.83，p 值 <0.05） 的条件下，鉴定出三组每对之间的潜在差异代谢物。在图 6a 和 b 中，与 Con 组相比，便秘大鼠的 347 种代谢物出现显著差异，其中 212 种代谢物显示显著增加，135 种代谢物显示减少。SDF 处理后，有 95 种代谢物上调，81 种代谢物下调，与 LOP 组观察到的结果相反。

图 6c 对 LOP 组和 SDF-H 组的差异代谢物进行了聚类分析，发现SDF 处理后胆酸、脱氧胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺胆酸、鞘氨醇和皮质酮水平显著升高，而吲哚-3-乳酸、腐胺、L-精氨酸、苯乙酸、苏氨酸和花生四烯酸水平显著降低。

利用 KEGG 数据库对 SDF-H 组和 LOP 组差异代谢物所涉及的代谢通路进行富集分析并将结果以气泡图形式呈现。如图6d 所示，按照 P-value 值大小展示前 10 条代谢途径，包括牛磺酸和次牛磺酸代谢、类固醇生成、脂肪细胞脂肪分解的调节、初级胆汁酸生物合成、卵巢类固醇生成、坏死性凋亡、甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢、胆汁分泌、精氨酸生物合成、醛固酮合成和分泌。其中类固醇生成、初级胆汁酸生物合成、甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢、胆汁分泌 4 条代谢途径在 SDF 治疗后得到显著的调节。

Fig. 6. Effects of SDF on metabolites and target genes. Volcanic map of LOP vs Con differential metabolites (a). Volcanic map of SDF-H vs LOP differential me­ tabolites (b). Cluster analysis map of differential metabolites (c). Bubble map of metabolic pathway analysis of differentially enriched metabolites in SDF-H and LOP groups (d). Effect of SDF on FABP1 mRNA expression in colonic tissues (e). Effect of SDF on SLC1A5 mRNA expression in colonic tissues (f). Values are expressed as means ± SD. Compared with the LOP group, ***P < 0.001，**P < 0.01.

2.6. 肠道微生物群与代谢物的相关性

图 7a 和 7b 表明，疣菌门在门水平上与胆酸和脱氧胆酸呈正相关。在属水平上，梭杆菌与胆酸呈正相关，而放线菌与胆酸呈负相关。

Fig. 7. Correlation of the Gut Microbiota and Metabolites. Heat map of the correlation of gut microbiota and differential metabolites between the LOP group and the

SDF-H group at the phylum level (a). Circos diagram of the correlation between intestinal microbiota and differential metabolites in the LOP group and SDF-H group

at the genus level (b).

2.7. SDF 对 FABP1 和 SLC1A5 表达的影响

图 6e 和 6f 显示，SDF 干预后，与 LOP 组相比，FABP1 和 SLC1A5 的 mRNA 表达显著增殖 （P < 0.01）。

Conclusion

SDF 具有良好的保水和溶胀能力。补充SDF能够改善便秘大鼠的排便状态，增加便秘大鼠的排便频率和粪便含水量，促进肠道转运能力的恢复，恢复 LOP 导致的胃肠活性肽水平异常变化，修复受损的肠道屏障，表现出缓解便秘的作用。SDF 缓解便秘的潜在机制如图 8 所示。

Fig. 8. Possible mechanism of action of SDF in alleviating constipation.

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