华东理工大学常雅宁教授团队：白杨素通过调节胰岛素抵抗HepG2细胞和HFD/ stz诱导的C57BL/6J小鼠的AMPK

成果介绍

（1）白杨素改善IR-HepG2细胞的葡萄糖摄取和消耗

与正常细胞相比，IR-HepG2细胞的NBDG摄取和葡萄糖消耗明显降低（图1B，C）。然而，白杨素处理有效地逆转了这种活性，正如在IR-HepG2细胞中升高的葡萄糖摄取和消耗所证明的那样。然而，我们发现IR + C15组与正常组之间没有显著差异。CCK-8实验结果显示，白杨素剂量对细胞没有毒性（图1A）。这些数据表明，白杨素可以改善体外葡萄糖的摄取和消耗。

白杨素抑制IR-HepG2细胞糖异生

qRT-PCR显示，相对于正常组，G6Pase和PEPCK mrna在IR中显著上调，并且这种活性被白白杨素处理有效逆转（图1D，E）。G6Pase和PEPCK在高浓度白杨素处理下的表达与正常对照相似。这些结果表明，白杨素可以通过下调IR-HepG2细胞中PEPCK和G6Pase的表达来抑制糖异生。

白杨素增强IR-HepG2细胞糖原合成和含量

抑制糖原合成是ir的另一个显著特征。1我们的研究结果表明，PA和高糖处理导致IR-HepG2细胞中糖原含量迅速下降，而白杨素处理则使糖原含量升高（图1G）。此外，白杨素还改善了ir诱导的p-GS （Ser641）水平升高和p-GSKβ (Ser9)水平降低（图1F，H，I）。提示白杨素通过刺激体外调节糖原合成的关键蛋白来提高糖原含量。

Chrysin调节IR-HepG2细胞中PI3K/AKT通路，激活AMPK通路

为了进一步研究白杨素在降低糖脂代谢中的作用，我们检测了胰岛素信号传导的关键分子p-IRS-1和p-AKT的水平。结果显示，与对照组相比，IRHepG2细胞中的p-AKT （Ser473）和p-IRS-1 （Tyr612）水平显著下降，尽管这种下降可以通过白杨素处理有效逆转（图1F，J，K）。与此同时，白杨素处理细胞中AMPK （Thr172）的磷酸化水平明显升高。

IR-HepG2细胞（图1F，L）。此外，相对于正常组，IR + C15组AMPK表达上调。

综上所述，在体外实验中，白杨素可以调节GSK-3β和GS水平，从而通过PI3K/AKT通路改善糖脂代谢，激活AMPK信号通路。

（2）AMPK抑制剂抑制白杨素对IR-HepG2细胞葡萄糖摄取、葡萄糖消耗和糖异生的影响。

为了探索AMPK的激活与白杨素改善糖脂代谢的作用之间的关系，我们在AMPK抑制剂存在的情况下评估了关键指标。结果显示，dorsomorphin显著逆转了白杨素对葡萄糖摄取和消耗的影响（图2A，B）。qRT-PCR分析显示，G6Pase和PEPCK在IR + C15 + Inh和IR组中表达水平相似（图2C，D）。这些结果表明dorsomorphin逆转了白杨素对IR-HepG2细胞葡萄糖摄取、消耗及糖异生的影响。

白杨素激活AMPK改善IR-HepG2细胞糖原合成并调节胰岛素信号通路

白杨素可下调IR-HepG2细胞中的pGSKβ，上调p-GS，而dorsomorphin最初抑制了这两种表达（图2F−H）。

在糖原合成方面也观察到类似的趋势（图2E）。此外，dorsomorphin抑制了p-AKT和p-IRS-1的水平，逆转了白杨素治疗最初的改善（图2F，I，J）。我们还观察到，相对于IR + C15组，IR + C15 + Inh组AMPK的磷酸化显著降低（图2F，K）。

综上所述，AMPK激活通过介导胰岛素信号通路，与白杨素活性对葡萄糖代谢的影响呈正相关。

（3）白杨素部分通过激活AMPK降低HFD/ stz诱导小鼠的体和组织重量并改善IR

通过HFD/ stz诱导小鼠的体内实验，进一步证实白杨素对糖脂代谢的影响，以及这些影响与激活ampk的关系。饲喂12周后，各组小鼠的体重和肌肉质量无统计学差异（表1）。但HFD/ stz诱导小鼠的平均体重明显高于正常小鼠，经白杨素处理后体重有所降低。与HF组相比，白杨素处理还显著降低了肝脏和附睾脂肪重量（表1）。值得注意的是，暴露于15和30 mg/kg的白杨素处理显著降低了HFD/ stz诱导小鼠的空腹血糖，增加了胰岛素分泌（表1）。白杨素还显著抑制了HFD/ stz诱导小鼠的HOMA-IR指数（表1）+ C15 + Inh组肝脏和附睾脂肪重量明显高于HF + C30组，但与HF + C15组相似（表1）。值得注意的是，HF + Inh组空腹血糖和胰岛素水平分别急剧上升和下降，而dorsomorphin治疗抑制了黄曲霉素对HOMA-IR指数的影响（表1）。OGTT分析显示了类似的趋势（图3A，B）。综上所述，这些结果表明，在体内，白杨素可以改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐量，而dorsomorphin可以抑制白杨素的部分作用。

白杨素部分通过激活AMPK改善HFD/ stz诱导小鼠的氧化应激和炎症

糖脂代谢与炎症和氧化应激的增加密切相关。在本研究中，对三种炎症标志物（IL-6、MCP-1和TNF-α）的分析显示，HF中所有标志物的水平均显著高于正常组，这一水平通过白杨素治疗呈剂量依赖性改善（表1）。此外，我们发现，在白杨素治疗后，血清和肝脏中SOD和GPx活性分别显著升高，肝脏中GSH也出现了这种现象（表1）。

HF组肝脏MDA水平明显高于正常组，尽管暴露于白杨素降低了这些水平（表1）。此外，高剂量白杨素对炎症和氧化应激有积极影响，尽管在用AMPK抑制剂治疗后，这些炎症和氧化应激部分受到抑制（表1）。这些结果表明，白杨素在体内有效改善炎症和氧化应激，部分是通过激活AMPK来实现的。

（4）白杨素部分通过激活AMPK改善HFD/ stz诱导小鼠的肝损伤、肝脂肪变性和脂质积累。

与正常小鼠相比，HFD/ stz诱导小鼠的ALT和AST水平急剧升高，尽管这些水平在白杨素处理后被有效抑制（图3C，D）。在HFD/ stz诱导的小鼠中，Chrysin处理抑制TC、TG和LDL-c水平，并增加HDL-c水平，尽管这些作用在dorsomorphin干预后被逆转（图3H - K）。

油红O染色和H&E染色显示HFD/ stz诱导小鼠肝脏脂肪变性明显。H&E染色也显示了严重的肝细胞凋亡和单核炎症细胞浸润，尽管这些都可以通过金甙治疗减轻，并呈剂量依赖性（图3E，F）。

此外，与HF + C30组相比，HF + C30 + Inh组小鼠表现出严重的肝损伤和脂肪变性（图3C−F）。HF + C30 + Inh组与HF + C15组间差异无统计学意义。这些结果表明，dorsomorphin在一定程度上逆转了白杨素在体内抑制肝损伤和脂肪变性以及减少脂质积累的作用。

(5)白杨素通过激活AMPK部分改善HFD/ stz诱导小鼠的糖脂代谢

与对照组相比，HFD/ stz诱导小鼠G6Pase和PEPCK明显上调。然而，白杨素以剂量依赖的方式抑制了这种作用（图4A，B）。

HF组SREBP1-c显著上调（图4C）。相反，白杨素处理组的下游蛋白FAS和ACC1显著下调（图4D，E）。白杨素治疗后PPAR-α水平明显高于HF组（图4G）。Chrysin处理相对上调pGSKβ (Ser9)和下调p-GS （Ser641）水平到HF基团（图4F，H，I）。此外，PAS染色显示了一致的结果，白杨素处理增加了红色染色的糖原含量（图3G）。此外，与HF + C30组相比，HF + C30 + Inh组相关mrna显著上调，尽管前者与HF + C15组无显著差异（图4A−E）。Dorsomorphin通过降低PPAR-α水平和调节p-GSKβ (Ser9)和p-GS （Ser641）的表达来抑制chrysin的作用。综上所述，这些数据表明，白杨素可以改善体内糖脂代谢以及AMPK，并在调节中发挥关键作用。

在HFD/ stz诱导小鼠中，Chrysin通过激活AMPK调控PI3K/AKT通路

与正常对照组相比，HF组小鼠的肝脏、肌肉和附睾脂肪中的p-AKT （Ser473）和p-IRS-1 （Tyr612）显著下调，尽管这种作用通过金苷治疗以剂量依赖性的方式被逆转（图4F、J、K和5A−C、E−G）。相反，白杨素在三种组织中以剂量依赖的方式显著上调pAMPK (Thr172)（图4F、L和图5A、D、E、H）。正如预期的那样，dorsomorphin显著下调p-AMPK的表达，如HF + C30 + Inh组的急剧下降。

然而，在dorsomorphin干预后，p-IRS-1和p-AKT下调，尽管HF+30 + Inh组和HF+15组之间没有显著差异（图4F、J、K和5A−C、E−G）。这些结果表明，白杨素可以通过激活AMPK在体内调节PI3K/AKT通路。

● 创新性/应用前景

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