河南大学国家食用菌加工技术研发专业中心在平菇不溶性膳食纤维对高脂饮食诱导肥胖大鼠的调节作用研究取得进展

成果介绍

Introduce

平菇（P. ostreatus）是仅次于双孢蘑菇的第二大担子菌食用菌，具有丰富的营养和药用价值。平菇的子实体富含膳食纤维和多糖。平菇的β-葡聚糖对缓解期乳腺癌患者细胞抗肿瘤免疫的免疫康复和更好的预后有潜在益处。但未见平菇膳食纤维改善肥胖功效及机制研究的报道，本文采用碱提法制备平菇不溶性膳食纤维（POIDF），检测其理化性质；通过饲喂高脂饮食建立大鼠肥胖模型，探究平菇不溶性膳食纤维对高脂饮食诱导肥胖大鼠的调节作用，并通过蛋白质组学和代谢组学揭示平菇不溶性膳食纤维改善肥胖的潜在作用机制。

Results and discussion

1. POIDF的理化性质和成分

采用碱提法，POIDF 的提取率为 28 %。对提取的POIDF的理化性质和成分进行了检测（表1），POIDF的持水力为5.61±0.13 g/g，持油力为0.76±0.14 g/g，膨胀力为4.52±0.47 mL/g。纤维素含量为 29.00 ± 1.00 %，半纤维含量为 41.62 ± 0.01 %，木质素含量为 11.63 ± 1.02 %。

2. POIDF 的结构表征

从图谱中可以看出（图 1A），POIDF含有纤维素和半纤维素的典型结构（3337.266 cm−1、 2917.336 cm−1）。1653.205 cm−1附近的小尖峰是由半纤维素羰基中 C-O 的不对称收缩振动形成的肩峰。1590 cm−1处的吸收峰可能与木质素中芳香族苯和糖醛酸的 C-O 拉伸有关。896cm−1 处吸收峰的尖锐度的增加与纤维素的 β-葡萄糖苷键有关。

DF的晶体结构类型可通过X射线衍射表征（图1B）。衍射角2θ在15 °-25 °范围内主要是纤维素和半纤维素的衍射峰，IDF具有典型的纤维素I型晶体结构，纤维素I型晶体可转化为纤维素II型晶体。X射线衍射图中峰越高，样品的结晶度越高，在19.83 nm处出现强衍射峰，这是I型纤维素的特征衍射峰（图1B）。使用origin映射POIDF的DLS（图1C）。由于IDF不溶于水，从图谱的峰形和PDI可以看出其粒径不均匀，在水溶液中的分布也不均匀。

Fig. 1. FT-IR spectrum (A), XRD pattern (B), and DLS images (C) of POIDF.

3. POIDF降低肥胖大鼠的体重和血脂水平

实验发现POIDF 组大鼠增重率低于模型组（Mod 组）和对照组，以高剂量组效果最好（图 2A）。与 Mod 组相比，补充 POIDF 可降低肥胖大鼠的BMI 指数、Lee,s 指数、脂肪指数和肝脏指数，表明POIDF 可以减轻肥胖大鼠附睾脂肪和肝脏的重量，从而减轻肥胖大鼠的体重。与 Mod 组相比，POIDF 可显著降低肥胖大鼠的 TG 、 LDL-C 和 NEFA 水平（图 2G，I-E）。此外，POIDF 可以抑制肥胖大鼠单位面积的附睾脂肪的大小（图 2F）。

Fig. 2. (A) Body weight throughout POIDF supplementation. (B) BMI index. (C) Lee's index. (D) Fat index. (E) Liver index. (F) Number of fat cells per unit area. (G-J)Serum TG, TC, LDL-C and NEFA levels. (***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05 vs Control; ###P< 0.001, ##P < 0.01, #P < 0.05  vs Mod).

4. POIDF可增强肝脏抗氧化能力，改善肝脏和附睾脂肪的病理变化

与Mod组相比，POIDF组能提高SOD水平，降低MDA含量，改善肥胖大鼠肝脏中的氧化应激（图3A-B）。肝组织病理学观察，高脂饮食可破坏肝脏结构，导致脂肪滴增多，肝细胞增大，肝索排列紊乱。补充POIDF可改善变化，且以中剂量组（POIDF-M组）效果最显著（图3C）。

Fig. 3. (A) Liver MDA content. (B) Liver SOD level. (C) H&E staining of liver tissue and epididymis fat. (***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05 vs Control;###P < 0.001, ##P < 0.01, #P < 0.05 vs Mod).

5. POIDF调节肥胖大鼠肠道菌群的丰度

从物种累积曲线的趋势可以看出，样品检测量是足够图4A）。根据Shannon指数，POIDF组的物种丰富度高于Mod组，ace指数也有相同的变化。Venn图显示，在Control、Mod和POIDF（POIDF-H、POIDF-M和POIDF-L）中总共有619个相同的OUT，并且在每组中存在不同的OUT分类（图4 B）。进一步通过LefSe聚类分析发现（图4 E），POIDF-L组中的不同微生物群包括瘤胃球菌、瘤胃球菌科、颤螺菌和毛螺菌科。在POIDF-M组中也检测到差异性微生物群，例如普雷沃氏菌科和普雷沃氏菌属。结果表明，POIDF可以改善OUT分类，增加物种丰富度。

在门水平上，POIDF补充可以逆转由高脂肪饮食诱导的螺旋体门、厚壁菌门和拟杆菌门丰度的变化，并且厚壁菌门与拟杆菌门的比例增加（图4F）。在属的水平上，高脂饮食降低了阿氏克罗伊茨菌、罗斯拜瑞氏菌、乳酸杆菌和p_75_a5的水平。POIDF-H组和POIDF-M组中，添加POIDF-H可增加普雷沃氏菌、粪杆菌和p_75_a5的丰度。同时，POIDF-M组中的阿氏菌、罗斯拜瑞氏菌、罗氏菌和乳杆菌的丰度也显著增加。此外，高脂饲料提高了YRC 22，Anaerotruncus，Collinsella和Allobaculum的丰度。补充POIDF还逆转了POIDF-H和POIDF-M组中颤孢菌属、柯林斯菌属和伯克霍尔德菌属的丰度的变化，以及POIDF-M组中YRC 22和异球藻属的丰度的变化（图4G）。

通过基因和基因组百科全书评估肠道微生物群的潜在功能，发现POIDF可逆转高脂饮食引起的脂类代谢、糖代谢、能量代谢和氨基酸代谢的改变（图4 H-I）。对SCFAs的影响发现，与Mod组相比，POIDF-H组、POIDF-M组的乙酸和丙酸水平显著增加；与Control组相比，高脂饲料喂养对丁酸水平的影响不显著，但POIDF-M组与Mod组相比，丁酸水平差异显著（图4J-L）。

Fig. 4. (A) Species accumulation curves. (B) Venn diagram. (C-D) α diversity group difference plot. (E) LefSe cluster map. (F) Phylum level. (G) Genus level. (H-I) Functional Difference Analysis. (J-L) SCFAs levels. (***P < 0.001 vs Control; ###P < 0.001, ##P < 0.01, #P < 0.05 vs Mod).

6.POIDF改善盲肠代谢物水平

根据≥1.2或≤0.83的倍数变化和P值<0.05筛选差异代谢产物，对照组差异代谢产物以火山图显示（图5A-B）。与对照组相比，Mod组上调了34种差异代谢产物，下调了32种差异代谢产物。与Mod组相比，POIDF-M组上调了32种差异代谢产物，下调了24种差异代谢产物。POIDF可调节代谢产物的分类（图5C），主要影响的差异代谢产物为脂肪酰类（图5D）。进一步筛选显示，三组中有25种不同的代谢产物，其中大部分属于氨基酸和脂肪酰类（表2）。通过代谢途径分析，富集差异代谢物见图5E-5F。与Mod组相比，添加POIDF组小鼠的代谢途径主要为：柠檬酸循环（TCA循环）、胰高血糖素信号通路、嘌呤代谢、泛酸和CoA合成、β-丙氨酸代谢、碳代谢、酮体合成和降解。提示POIDF可改变高脂饲料诱导的嘌呤代谢富集和酮体合成与降解。

Fig. 5. (A-B) Volcano map of differential metabolites. (C) Differential metabolite clustering heat map. (D) Metabolite classification bar chart. (E-F) Bubble plots for metabolic pathway enrichment analysis.

7. POIDF调节肥胖大鼠肝脏蛋白水平

本文使用TMT定量技术对对照组、Mod组和POIDF-M组的肝组织进行非靶向蛋白质组学研究。与对照组相比，Mod组上调361个差异蛋白，下调308个差异蛋白。与Mod组相比，POIDF-M组上调了596个差异蛋白，下调了190个差异蛋白（图6A-B），共有186个差异蛋白（图6C）。KEGG通路富集分析发现POIDF可能通过视黄醇代谢、PPAR信号通路、脂肪细胞因子信号通路、氨基酸生物合成和类固醇生物合成信号通路介导在减脂中起作用（图6D-6E）。网络分析发现，差异蛋白同时富集在多个信号通路中（图6 F-6G）。

Fig. 6. (A-B) Volcano diagram of significantly differential proteins. (C) Venn diagram of differential proteins. (D-E) Statistics of pathway enrichment of differentially expressed proteins in each pairwise. (F) Network analysis of Pathway terms. (G) Expression profile of key differential proteins. (**P < 0.01, *P < 0.05 vs Control;  ##P < 0.01, #P < 0.05vs Mod).

8. 差异代谢产物与关键蛋白质和微生物群的关联分析

本文使用Splenda函数分析Mod组和POIDF-M组之间不同蛋白质和代谢物的关联（图7A）。使用Circus plot函数来可视化结果。结果发现OXCT 1和UQCR 11与Dl-α-氨基辛酸和11（z），14（z）二十碳二烯酸呈负相关；与N-乙酰脯氨酸和L-酪氨酸甲酯呈正相关。PLIN 2与Dl-α-氨基辛酸和11（z），14（z）-二十碳二烯酸呈正相关，与N-乙酰脯氨酸和L-酪氨酸甲酯呈负相关。结果提示，POIDF可能通过调控关键蛋白的表达来调节小分子代谢产物的水平。

为了探索盲肠内容物中微生物群与小分子代谢物之间的关系，将秩相关分析和典型相关分析相结合以形成相关网络图（图7 B）。对Mod组和POIDF-M组中的差异代谢物和微生物组进行相关性分析。结果表明，Dl-α-氨基辛酸和11（z），14（z）二十碳二烯酸与Allobaculum、Anaerotruncus、Collinsella和YRC 22呈正相关。与Adlercreutzia、Lactobacillus、Roseburia和Rothia呈负相关。N-乙酰脯氨酸和L-酪氨酸甲酯与Allobaculum、Anaerotruncus、Collinsella和YRC 22呈显著负相关，与Adlercreutzia、Lactobacillus、Roseburia和Rothia呈显著正相关。结果表明，POIDF不仅调节肠道降解后细菌群落的比例，而且可能调节盲肠内容物中代谢产物的水平。

Fig. 7. (A) Circos diagram of correlation between differential proteins and differential metabolites. (B) Ring diagram of correlation between the co-expression clusters of metabolites and microbial groups.

Conclusion

POIDF降低肥胖大鼠的体重，主要是通过降低大鼠的脂肪系数和肝脏指数，降低血脂水平，改善脏器的病理改变。组学结果表明，POIDF可以调节肝脏DPP4、MT1M、OXCT1、UQCR11、TM7SF2和PLIN 2等关键蛋白的表达，提高盲肠内容物中脂肪酰基和氨基酸等关键代谢产物的水平，改善柠檬酸循环（TCA循环）、胰高血糖素信号通路、嘌呤代谢、泛酸和CoA生物合成、β-丙氨酸代谢和碳代谢，合成和降解酮体等代谢途径，调节肠道微生物，促进脂质分解和能量代谢，达到减肥的作用。本研究对平菇膳食纤维的降脂机理有了更清晰的认识，为合理开发利用平菇膳食纤维提供了有力的支持。

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