早期肺腺癌亚型特征及快速诊断工具的研究进展

AIS是一种浸润前病变，直径≤3 cm的局限性小腺癌，无间质、血管或胸膜浸润，多出现在肺外周，靠近胸膜。MIA则是以附壁样结构为主、伴有最大径≤5 mm浸润灶的孤立性小腺癌（≤3 cm），CT上多表现为磨玻璃样结节（ground-glass nodule，GGN），固体成分<5 mm。IAC是临床中最常见的类型，主要分为LPA、APA、PPA、MPA、SPA 5种亚型[4-5]。LPA的肿瘤组织由肺泡Ⅱ型细胞和/或Clara细胞组成，细胞形态与AIS、MIA类似，肿瘤细胞沿肺泡壁表面生长。MPA的肿瘤细胞胞体偏大，呈立方形，细胞质嗜酸性，部分病例可见沙砾体结构，微乳头可附着于肺泡壁或脱落至肺泡腔内。SPA的肿瘤组织呈实性团块，核异型，核膜厚，多数呈空泡状，核仁明显，核分裂活跃[14-15]。何小群等[16]发现，在CT上，SPA/MPA相较于LPA/APA/PPA，肿瘤直径更大、实性密度更高、更容易出现钙化、坏死及胸腔积液，而LPA/APA/PPA血管集束征及充气支气管征的出现率均显著高于SPA/MPA。

Qian等[17]发现基因5突变集（包括基因PIK3CG、ATM、EPPK1、EP300和 KMT2C）和基因3突变集（包括基因ATR、KDM6A和POLQ），前者与较差的总生存率（overall survival，OS）相关，其可能代表了促进肿瘤进展的关键早期驱动因素，后者与更好的OS相关；突变集中ATM和ATR基因是癌症治疗中很有吸引力的治疗靶点。Inamura等[5]的研究发现，端粒缩短和DNA损伤反应被认为是肺癌发生的早期事件，其中重组人转化生长因子β受体-2的抑制决定肺腺癌的侵袭性。Kawasaki等[18]的研究发现FAM111B（family with sequence similarity 111 member B）的表达与恶性进展相关，在PPA中FAM111B的表达高于其他类型腺癌。Molina-Romero等[19]发现，与其他亚型相比，LPA是唯一表现出显著基因表达差异的亚型，其中上调基因3个：载脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）、脾周围蛋白（periplakin，PPL）和细胞粘附分子1（cell adhesion molecule 1，CHL1），下调基因10个：CTP合成酶1（CTP synthase 1，CTPS1）等。

骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是分泌细胞外基质相关的蛋白，属于转化生长因子β超家族[20]。Deng等[21]分析了NSCLC组织中BMPs家族成员的mRNA水平，其中肺腺癌组织中BMP5的mRNA水平明显高于肺鳞癌，提示BMP5可能是NSCLC患者潜在预后生物标志物或治疗靶点。Zhou等[22]将IAC的主要亚型分为3组：涉及附壁样的低级别组（LR）、涉及腺泡样和乳头状的中级别组、涉及实体型和微乳头状的高级别组（HR），对3组肿瘤组织进行无标记的定量蛋白质组学和生物信息学分析，最终在LR和HR的肿瘤组织中共鉴定出3个蛋白簇，共192个差异表达蛋白。蛋白簇1（65个蛋白）中的蛋白表达水平从LR组至HR组依次递减；蛋白簇2（70个蛋白）中的蛋白表达水平从LR组至HR组依次递增；蛋白簇3（49个蛋白）中的蛋白仅在LR中高表达。基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）是锌依赖的内肽酶家族中的一员，其促进细胞增殖、迁移和分化，并可在细胞凋亡、血管生成、组织修复和免疫应答中发挥作用[23]。Yu等[24]发现，MMP9活性在MPA和SPA中最高，LPA中最低；进一步证实，在早期肺腺癌完全切除后，高水平的MMP9活性与侵袭性肿瘤行为和不良的临床预后相关。

1962年，Shimkin等发现，肺叶切除术后的生存率相当于全肺切除术，并发症更少；此后，肺癌的肺叶切除术成为肺叶切除程度的金标准[25]。1973年，Jensik和他的同事首次描述了肺癌的解剖节段切除术，SLR进入人们的视线；此后，SLR（肺楔形切除术或段切除术）手术方式成为早期肺腺癌（特别是高危患者）手术的一种选择[26]。美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南[27]建议SLR适用于那些不适合肺叶切除术或周围型NSCLC<2 cm且低度恶性患者。Zeng等[28]的Meta分析纳入12项研究，比较了Ⅰ期NSCLC患者电视辅助胸腔镜手术（video-assisted thoracoscopic surgery，VATS）肺段切除术与VATS肺叶切除术两组患者的围手术期和肿瘤结果，结果显示，VATS肺段切除术患者术后住院时间和淋巴结清扫数量均显著缩短或减少。Berg等[29]和Kent等[30]认为，SLR既可以较好地保留术后肺功能，也可以减少包括肺炎在内的短期和长期肺部并发症。但Nitadori等[11]发现，肺腺癌中微乳头状成分占比≥5%的接受SLR治疗的肿瘤患者比接受肺叶切除术治疗的患者有更高的复发风险。Yoshida等[31]的研究也表明，在接受SLR治疗的患者中，微乳头状（≥5%）亚型的局部复发率更高。SLR适应精准治疗的发展，但它也有局限性。因此，能在术中指导早期肺腺癌手术方式选择的快速诊断工具或可弥补这一局限性。

Sun等[10]的研究发现，与最终病理结果相比，术中冰冻切片区分微乳头状和实体型成分百分比≤5%和>5%的一致率为87.9%；而将微乳头状和实体型成分的百分比进一步分为4组（<5%、5%、10%～20%或>20%）时，一致率下降至65.7%，体现了术中冰冻病理检查诊断的局限性。Yeh等[32]回顾了361例切除的Ⅰ期肺腺癌（≤3 cm）的冰冻病理检查和最终石蜡病理检查的主要组织学亚型（包括附壁样、腺泡样、乳头状、微乳头状和实体型）。结果显示，术中冷冻病理检查预测主要组织学亚型的准确性为68%（κ=0.565）；敏感性最高为腺泡样（90%），最低为微乳头状（37%），可见术中冷冻病理检查诊断微乳头状和实体型的敏感性并不令人满意。Trejo Bittar等[33]的研究结果表明，术中冷冻病理检查判断肺腺癌主要组织学亚型的准确率为69.7%（78/112），与石蜡病理检查的总体一致性为“中度”（κ=0.51），运用冰冻病理检查准确评估肺腺癌组织学亚型是具有挑战的。

2.2.1   抗体芯片技术的应用现状

抗体芯片是蛋白质芯片的一种，是检测生物样品中蛋白表达模式的新方法，具有高通量、快速、所需样本量少等优点。其原理是在一块微小的固体表面上高度密集排列抗体点阵，特异性地摄取生物样品中的靶蛋白（抗原），通过检测系统对靶蛋白进行定量和定性分析。目前抗体芯片应用于肝癌、肺癌、卵巢癌等癌症的研究[34-35]。Shan等[36]用抗体芯片筛选与肺癌相关的自身抗体。邓安梅等[37]用蛋白质芯片试剂盒联合检测肺癌患者血清肿瘤标志物达到80%的阳性率，为临床诊治提供有价值的依据。Han等[38]利用抗体芯片对健康人群和肺癌患者血清进行蛋白质分析，筛选出潜在肺癌生物标志物。Nagano[39]则使用抗体芯片技术筛选出了2种与肺癌转移相关的新的生物标志物。

2.2.2   半干斑点印迹技术的应用现状

半干斑点印迹技术（semi-dry dot-blot，SDB）基于斑点印迹技术，可以验证肿瘤细胞的存在。肿瘤标本洗涤后沉淀肿瘤细胞，并提取特异性蛋白，然后点加到硝酸纤维素膜（或尼龙膜）上用已标记的探针进行杂交，再通过显影来验证肿瘤细胞的存在。Hirakawa等[40]在2010年首次描述SDB是一种简单、快速、经济有效的点印迹分析方法，可用于快速检测淋巴结转移，但检测病例积累不足，暂无法判断该方法对临床标本分析的有效性。Otsubo等[41]使用SDB检测了乳腺癌患者的前哨淋巴结，结果显示SDB方法的敏感性、特异性和准确性均不低于冰冻病理检查，分别为100.0%、98.0%和98.3%；SDB方法简单、准确、方便、可行，术中诊断前哨淋巴结转移，不丢失淋巴结组织，可同时进行病理诊断并应用于其他癌症。Tomoshige等[42]使用SDB诊断NSCLC淋巴结转移，该研究显示SDB耗时短，平均检测时间为43 min，与冰冻病理检查时间相仿；敏感性高，可以发现低至0.01 mg/mL的肿瘤蛋白；总体准确率不亚于术中冰冻病理检查，故而有良好的术中应用前景，适用于特定肿瘤的快速准确诊断。Otsubo等[43]的后续研究中，基于SDB开发了一种联合试剂盒，检测乳腺癌的转移性淋巴结：区分大转移和非大转移；其结果显示在诊断不发生淋巴结组织丢失的淋巴结转移方面准确、快速、成本低，具有良好的临床应用价值。

综上，不同亚型肺腺癌的预后、蛋白表达不同，利用抗体芯片技术筛选出肺腺癌不同亚型之间的特异性蛋白，然后将筛选出来的特异性蛋白结合半干斑点印迹技术，用于术中检测肺腺癌不同亚型的成分，或可成为一种不错的快速诊断肺腺癌亚型方法。

质谱分析（mass spectrometry，MS）是近年来迅速发展的基于样品中分子组成或含量不同而实现样品检测的一种快速分析测试方法，可在无需样品预处理的情况下对各种临床样品进行分析[44]。MS现已广泛应用于肺癌的研究中（包括组织分子识别、潜在生物标志物的发现和手术切缘评估）[45-46]。Lee等[47]利用基质辅助激光解吸/电离质谱分析法（matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry，MALDI MS）证实了腺癌和鳞癌具有不同的脂质谱，并且试验结果表明，其可准确区分肿瘤和邻近的正常组织，并根据组织学类型分类NSCLC。徐建军等[48]的研究中，常压直接质谱分析技术（ambient mass spectrometry，AMS）被用于快速鉴别肺癌与癌旁组织，结果表明，AMS耦合主成分分析能够有效将肺癌与癌旁组织样品的质谱指纹区分，从而快速鉴别肺癌与癌旁组织，并获得相关样品的分子尺度信息，为快速诊断肺癌及肺癌肿瘤标志物研究提供新的思路和策略。Zhang等[49]对2015年1月1日—2020年11月20日期间利用MS技术在人类NSCLC组织脂质中进行的相关研究作了文献综述，结果提示脂肪酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等脂质含量在肺癌组织和健康组织之间存在显著差异，腺癌和鳞癌亚型的脂质谱不同，可以结合MS技术和多种鉴别模型，根据脂质谱来区分NSCLC组织亚型和健康组织，为术中评估手术切缘和癌症亚型提供新机会。研究[47-48]表明，质谱分析法具有直接（无需样品预处理）、分析速度快、耗费样品少等特点，可为肿瘤快速诊断提供参考。

近年来，人工智能（artificial intelligence，AI）迅猛发展，已有不少基于CT影像的AI辅助诊断系统诊断肺癌的有效性研究，在 CT 检查中应用 AI 辅助诊断系统具有效率、效能高的优点[50]。陶学敏等[51]利用深度学习模型对240例经病理证实在CT上表现为纯磨玻璃样结节（pure ground-glass nodule，PGGN）的肺腺癌进行分型，将肺腺癌分为非IAC组和IAC组，并与手术病理结果进行对比，探讨其对病理亚型的预测价值。结果显示，深度学习模型对PGGN判断的准确率为0.8330，诊断效能优于专家组判断。Wang等[52]则将生成对抗网络（generative adversarial network，GAN）和卷积神经网络（convolutional neural network，CNN）结合，构建了一种肺腺癌自动分类系统，对206例术后病理标记的肺结节进行分析，并与传统的原始增强图像和普通增强图像的训练方法对比。结果显示，与使用原始增强图像和普通增强图像的训练方法相比，GAN增强方法的分类准确率分别提高了23.5%（从37.0%提高到60.5%）和7.3%（从53.2%提高到60.5%）。He等[53]基于放射组学特征，建立了机器学习模型，用于预测IAC的微乳头状/实体型成分，结果显示，应用于机器学习分类的放射组学特征与肺腺癌的组织学亚型显著相关，机器学习模型可以用于预测肺腺癌中微乳头状/实体型成分的存在，并且具有无创、经济的特点。AI的运用不局限于影像学诊断，随着全载玻片成像扫描技术的发展，AI技术已逐渐运用于病理学诊断，且已被证明可以提高组织病理学评估效率、准确性和一致性[54-55]。基于深度卷积神经网络（deep convolutional neural network，DCNN），Teramoto等[56]使用6000例肺癌的样本图像训练自动化分析软件8 h，对肺癌组织图像进行旋转、反转和过滤处理，对82例腺癌、125例鳞癌和9例小细胞癌图像进行了组织学分型，腺癌分型结果的正确率为89.0%、鳞癌的正确率为60.0%，小细胞癌的正确率为70.3%，总体正确率为71.1%。Yu等[57]建立了CNN模型来区分肺腺癌和鳞癌的组织病理学亚型，并在一个独立队列中进行了验证，得到较好的分类结果。前面的研究都局限于肺癌亚型分类，而Wei等[58]则是针对肺腺癌的组织学亚型（附壁样、微乳头状等）构建了一个深度学习模型，可以自动对术中肺腺癌肿瘤标本切片的组织学模式进行分类。该模型使用CNN来识别肿瘤细胞区域，然后聚集这些分类，以推断任何给定的整张图像的主要和次要组织学亚型，并在一组独立的数据集（143例）中评估了模型的效能，其结果和3位病理学家的判读结果相当。

综上所述，肺腺癌是一种具有高度异质性的肺癌类型，不同肺腺癌亚型的特征各不相同。对于LPA，SLR（肺段切除或者肺楔形切除）已经足够；而对于含有微乳头状和/或实体型成分的肺腺癌，需接受肺叶切除术。然而目前的术中快速冰冻病理检查对肺腺癌亚型诊断的准确性较低，特别是对于含有微乳头状和/或实体型成分的肺腺癌。因此，为了提高诊断的准确性，进一步实现早期肺腺癌患者的精准治疗，有必要探索和寻求新的方法和技术。利用抗体芯片技术筛选肺腺癌亚型之间的差异蛋白，进一步结合SDB建立一种新的诊断工具或可以简单、准确、快速地诊断肺腺癌亚型。AI具有高效、准确、一致的特点，通过深度学习，建立一种识别肺腺癌微乳头状和/或实体型成分的模型或系统，将其运用于术中冰冻切片的判读，或许可以帮助病理学家更精准地识别肺腺癌的组织学模式。目前已有研究证实质谱分析法可以正确区分肺癌与癌旁组织，进一步的研究是否可以关注到肺腺癌不同组织学模式的分子尺度信息，从而将其运用到肺腺癌术中的快速诊断。虽然以上几种快速诊断方法的研究都还处于初步阶段，仅为单中心研究，且研究对象的数量有限，但他们的研究方法为后续研究提供了思路。相信在不久的将来，经过更进一步的研究及临床探索，可建立一种快速、准确的诊断工具，从而指导肺腺癌治疗策略的制定，实现早期肺腺癌患者手术的个体化精准治疗。

利益冲突：无。

作者贡献：王奎阅读文献，撰写文章；张宏毅查阅文献；庞瑶整理文献；朱自江修改文章。

参考文献略。