摘要：小麦种质资源对研究及育种至关重要，可通过多种途径丰富。本研究利用甲基磺酸乙酯(EMS)在中国小麦品种'鲁研128'、'济麦38'、'济麦44'和'山农30'中创建了巨大规模的EMS突变体库(MEP)。M1代表现出丰富的表型变异，包括叶绿素缺失、紧凑穗、雄性不育等，部分变异可遗传至M2或M3代。采用单种子后代(SSD)法提升世代，M2代种子用于筛选重要农艺性状。MEP为小麦遗传育种提供了宝贵资源。
关键词：小麦；种质；甲基磺酸乙酯；遗传育种
文 章 信 息
译名： 构建大型 EMS 突变体库用于小麦的功能基因组学和育种
发表时间：2023年5月15日
期刊IF：4.6 （2024）
第一单位：泉脉农业科技有限公司，枣庄学院生命科学学院
通讯单位：泉脉农业科技有限公司，小麦育种全国重点实验室，山东农业大学农学院
文 章 亮 点
1.利用中国小麦品种创建了巨大规模的EMS突变体库(MEP)。
2.M1代表现出丰富的可遗传表型变异。
3.MEP为小麦遗传育种提供了宝贵资源。
文 章 简 介
1. 研究意义
小麦是世界范围内的主要粮食作物，在自然界中，小麦生产面临许多非生物和生物胁迫。小麦高产、优质育种最好的途径是在庞大的种质库中挖掘遗传潜力。目前，大多数小麦栽培品种的遗传背景非常狭窄，因此，需要丰富小麦基因库，以可持续的方式改良小麦品种。
化学诱变，特别是甲基磺酸乙酯(EMS)，在育种中具有重要意义。EMS能引发多种遗传变异，包括碱基转变和缺失，已在多种植物中广泛应用。。在植物中，EMS诱变最早于1964年在大麦中使用。迄今为止，已经在多种植物中进行了数千次EMS诱变实验。小麦及其野生近缘种的所有EMS群体中的一小部分被总结在表1中。
部分EMS突变体群体附有外显子组数据和在线BLAST工具，便于突变鉴定。这些突变体已被广泛用于基因克隆和遗传学研究。同时，一些突变群体也被用于性状发掘，如除草剂抗性突变体的鉴定。因此，小麦EMS种质是小麦遗传改良基础和应用研究的宝贵资源。对于本研究中的EMS诱变，我们选择了在2020年至2021年期间发布最多的小麦品种。筛选出的小麦品种将有可能在未来5年内引领山东小麦市场。因此，我们创建了一个巨大规模的EMS群体( MEP )，为促进性状发现和生物技术小麦育种提供了宝贵的种质库。
2. 研究方法
3. 研究结果
3.1 在M1代中表现出多种突变性状
2022年4月至6月，我们对田间首批609K个M1代植株进行了考察（附录G），发现了多种表型变异。
叶绿素缺乏：这类突变体在营养器官，尤其是叶片上，出现不同颜色或病斑模拟斑。通常，只有一个分蘖表现出这种表型（图2），表明分蘖间存在遗传嵌合体。我们挑选了1976个具有白化、淡绿、黄或条纹叶片的斑驳突变体（图2），以及1091个叶片上有病斑模拟斑的突变体。叶绿素缺乏可作为EMS诱变的可视化标记。在本研究中，每八个播种孔中至少有一个出现叶绿素缺乏，尽管我们只挑选了一小部分斑驳或病斑模拟突变体。尽管几乎所有斑驳表型在M2代中消失，但一些病斑模拟表型在M2和M3代中仍可见。
紧凑型穗：野生型四个小麦品种的穗长正常，平均约11cm。然而，许多M1代植株的穗紧凑型，平均长度约5.5cm，且仅出现在每个植株的一个分蘖上。我们挑选了2519个紧凑型穗，并将其进一步分为五种形状：椭圆形、锥形、纺锤形、棒状和长圆形（图3）。
雌雄不育：植物雌雄育性对性繁殖至关重要，而雌雄不育则对利用杂种优势也很重要。本研究中，我们鉴定了1692个雄性不育穗，约95%仅出现在一个分蘖上（图4）。为维持这些品系，我们人工采集了可育花粉粒，并对雄性不育品系进行人工授粉以产生下一代种子。我们还注意到，许多穗在开花后三到四周结实较少，且随机分布在穗上，可能是由雌性胚胎致死基因引起，我们选择了555个这种表型的穗。雌雄不育突变体已种植于田间，将在M2代进一步鉴定。
蜡质减少：大多数小麦品种有一层覆盖在角质层上的额外蜡质。蜡质可减少植物蒸腾作用，但也可能降低CO2吸收和光合效率。本研究中，‘济麦44’的蜡质远少于‘鲁原128’、‘济麦38’或‘山农30’。我们在田间从‘鲁原128’、‘济麦38’和‘山农30’群体中鉴定了30个蜡质减少的突变系。与其他通常仅出现在一个分蘖上的突变性状不同，蜡质减少在每个植株的多个分蘖上均存在。这些突变体的所有地上组织均为浅绿色，在拔节期后更为明显（图5）。
每分蘖双穗：该群体包括一些不寻常的突变，如每分蘖双穗和芒毛扭曲。双穗性状可能通过增加植物冠层内的气流或提高产量潜力来改善小麦。我们鉴定了30个双穗突变体，并将其进一步分为五类（图6）。共收获781粒M2代种子并种植于温室，但遗憾的是，它们均未进一步发育出双穗表型。显然，小麦每分蘖双穗不可遗传，或依赖于多个基因的杂合性。理论上，如果基于三套三套同源基因（即9个基因），则仅有0.2%的M2代种子能发育出双穗。然而，需要更多数据来确定小麦双穗突变是否可遗传。
3.2 小麦MEP的有效性
对于每个品种，我们制备了5个单粒复合体( SSC )，每个突变体植株仅有1粒种子。采用单种子后代( SSD )方法，用于推进每个突变群体。田间每穴可能有多株植株，但我们以独立的植株进行取样，通常每株有4 - 5个分蘖(附录G )。我们还制备了一个全种子复合物( ASC )，其中包含所有突变体植株的所有剩余M2种子。M2种子具有最多的诱导突变，它们无疑是小麦改良的有价值的基因库。到目前为止，我们已经制作了ASC库供协作使用。今后，我们还将为'济麦38 ' 400K双诱变系制备SSC和ASC库。
4. 讨论
4.1 实现小麦中有效的EMS诱变
EMS是一种高效的化学诱变剂，其诱变效果受多种因素影响，包括EMS品质、溶剂、温度、pH值、处理时间及植物基因型等。因此，针对特定植物基因型，需通过测试不同EMS浓度梯度来找到最优剂量。本研究设定了能产生20-30%正常生长率突变体的EMS剂量，确保突变体库（MEP）具有高突变密度。叶绿素缺乏导致的斑驳和斑点突变在诱变后较为常见，本研究中约有1%的分蘖和5%的表型异常植株表现出此表型，且大部分可遗传。此外，我们还回收了大量紧凑穗型植株，进一步证明了M1代的高突变率。
4.2 M1种子在田间条件下需要细心养护
诱变处理后的种子需精心种植，以建立高质量的突变体种群。本研究发现，尽管温室条件下20-30%的处理种子具有正常生长表型，但田间萌发率却极低。这可能是由于物理或化学损伤导致M1种子失去大量萌发活力。因此，直接在田间种植诱变种子可能导致测试失败。为加速基因发现和小麦育种，我们开发了四步法生产并测试MEP：大量均匀处理种子、每洞种植多粒种子以减少不萌发影响、使用泥炭藓床提高萌发率、在寒冷气候下使用塑料地膜加速生长。此方法不仅适用于小麦，也适用于其他主要作物。
4.3 小麦M1植株中的遗传嵌合体现象
遗传嵌合体是指同一植株上相同类型的器官在相同条件和发展阶段下出现表型变异的现象。本研究在筛选EMS诱变的雄性不育突变体时也观察到了这一现象。在小麦M1植株中，同一植株的多个分蘖中可能只有一个表现出叶绿素缺乏、紧凑穗或双头等现象。在极端情况下，甚至同一穗的不同部位也可能出现不对称发育。这些现象表明，即使在单个器官的分蘖中也存在遗传嵌合体。这可能是由于多细胞原基的所有细胞都经历了独立的诱变，导致不同诱变细胞发育成的芽器官或小穗器官间存在遗传差异。因此，在小麦M1植株中，遗传嵌合体现象很常见。如果目标是保持所有遗传变异性，那么保留所有分蘖对于未来的性状发现至关重要。这有助于充分挖掘MEP资源，为小麦育种提供更多可能性。
5. 主要结论
以中国小麦品种'鲁研128 '、'济麦38 '、'济麦44 '和'山农30 '为材料，完成了EMS突变体库( MEP )。MEP表现出规模大、内容丰富的特点。表型变异包括叶绿素缺乏，穗紧凑，雄性不育或雌性不育，表皮蜡质减少和每分蘖双穗。我们将在适当的条件下继续筛查额外的突变。此外，还建立了一个大规模EMS群体的培育方案，并采用5个单粒复合( SSC )加单粒后代( SSD )的方法将整个MEP提前到更高的世代。本研究制定的方案和开发的MEP对基础研究和小麦育种都具有较高的应用价值。
Reference:
Wang, W., Guan, X., Gan, Y., et al. (2024). Creating large EMS populations for functional genomics and breeding in wheat. Journal of Integrative Agriculture, 23(2), 484–493.
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.jia.2023.05.039
本期分享来自2023级草学专业硕士研究生韦继芝
