![]()
摘要：这土壤碱化严重影响植物生长，但植物对碱性胁迫的反应机制仍不清楚。本研究通过生理和转录组分析，比较了两种对碱性敏感性不同的紫花苜蓿（Medicago sativa L.）品种：碱敏感的Algonquin（AG）和碱耐受的Gongnong NO.1（GN）。结果显示，AG在碱性处理（0–25 mM Na2CO3）后，叶绿素含量和茎鲜重显著下降，而GN则保持了相对稳定的生长。GN的Ca2+和Mg2+含量及其与Na+的比率、脯氨酸和可溶性糖的水平更高，且过氧化物酶（POD）和催化酶（CAT）的酶活性增强。转录组分析识别出三类碱性响应差异表达基因（DEGs）：48个共同诱导基因（CAR）、574个耐碱基因（TAR）和493个敏感基因（SAR）。功能分析显示，CAR基因参与苯丙素生物合成等过程，TAR基因富集于氨基酸和次级代谢途径，而SAR基因则与维生素B6代谢相关。这些发现为紫花苜蓿的碱性耐受机制提供了新见解。
关键词：紫花苜蓿；碱胁迫；转录组
文 章 信 息
译名：生理和转录组分析揭示了紫花苜蓿（Medicago
sativa L.）对碱性胁迫的品种特异性反应的新发现
发表时间：2021年11月22日
期刊影响因子：6.2（2023）
第一单位：中国科学院东北地理与农业生态研究所
文 章 亮 点
1.碱胁迫（25 mM Na2CO3）降低了紫花苜蓿幼苗的叶绿素含量和生长；
2.碱耐受品种表现出更好的离子平衡和活性氧（ROS）稳态：
3.MAPK信号通路和次级代谢过程参与了碱性耐受性
文 章 简 介
1 研究意义
本研究揭示了紫花苜蓿（Medicago sativa L.）在碱性胁迫下的响应机制，具有重要的科学价值和实际应用潜力。土壤碱化已成为全球农业面临的重大挑战，显著影响作物的生长和产量。通过对两种不同碱性敏感性紫花苜蓿品种的比较，本研究深入探讨了碱性胁迫对植物生理和分子水平的影响，提供了理解植物应对环境压力的新视角。研究结果表明，碱耐受品种在离子平衡和活性氧稳态方面表现出更强的适应能力，为耐碱性作物的育种提供了潜在的遗传基础。此外，MAPK信号通路与次级代谢物的相关性揭示了特定信号传导机制和代谢途径在碱性耐受性中的关键作用。这些发现为未来的育种工作及功能基因的鉴定提供了重要指导，推动了作物改良研究的进展。不仅为紫花苜蓿的碱性耐受机制提供了新的见解，也为应对土壤碱化问题的农业可持续发展提供了理论依据，具有重要的生态和经济意义。2 研究方法
选择一个耐碱性品种——Gongnong NO.1（GN），以及一个敏感的品种——Algonquin（AG）。种子使用0.6%次氯酸钠溶液消毒10分钟，然后用蒸馏水冲洗三次。十五颗种子被播种在直径25
cm、深度20 cm塑料盆中，盆内填充沙子，幼苗在受控的生长室中培养，生长条件为白天25 °C/夜间20 °C，12小时光照周期，光强约为350 μmol photons m−2s−1。盆土在14天内用蒸馏水灌溉，直到达到第一片三叶的阶段，随后在接下来的10天中每天提供Hoagland营养液。为确定Na2CO3的适当处理浓度，将25天的紫花苜蓿幼苗（大约在第三片三叶阶段）分别用0 mM、10 mM、15 mM、20 mM和25 mM的Na2CO3溶液处理7天。观察到两种品种之间在膜损伤（MI）方面存在显著差异，因此选择了25 mM Na2CO3（pH
= 11.2，电导率（EC）= 3.7 mS cm−1）作为模拟碱性胁迫的浓度。为了确定碱性胁迫处理的最佳时间点，在碱性处理后的1天、3天、5天和7天收集25天大的紫花苜蓿幼苗的叶片，以测定丙二醛（MDA）含量。在七天的碱性处理后，两种品种之间观察到显著差异，因此我们将第七天作为处理时间。在碱性胁迫实验中，紫花苜蓿品种的幼苗（GN和AG）用蒸馏水处理作为对照（命名为CGN和CAG），而接受碱性处理（25 mM Na2CO3）的组别命名为TGN和TAG。每次处理结束时，从顶部收集完全展开的第三片叶子，储存在−80
°C以备后续的RNA-seq、qRT-PCR和生理生化分析。收获后立即测量植物的茎干鲜重。所有实验均进行了三次生物重复，每个重复包含4个盆栽，且每个盆内有15颗幼苗。三次重复在生长室内每1-2天进行位置轮换，以尽量减少位置效应。3 研究结果
3.1 植物对碱胁迫的生长与生理反应
在碱性条件下，敏感品种（AG）的叶片黄化现象十分严重(Fig.
1A, B)。与对照处理相比，AG在经过七天的碱性处理（25 mM Na2CO3）后，其茎干鲜重(Fig.
1C)和叶绿素含量(Fig. 1D)分别显著降低了39.17%和46.69%，而GN则表现出相对稳定的生长和叶绿素含量。碱性处理诱导了GN和AG中可溶性糖的积累，分别增加了1.39倍和1.33倍(Fig. 2A)，脯氨酸则分别增加了3.46倍和2.55倍(Fig. 2B)。此外，碱性处理还分别使GN和AG中的过氧化物酶（POD）活性增加了4.38倍和2.20倍(Fig. 2C)，而催化酶（CAT）活性则增加了9.15倍和1.86倍(Fig. 2D)。在金属离子方面，Na+含量(Fig. 3B)增加，而K+（图3A）、Ca2+(Fig. 3C)和Mg2+(Fig. 3D)含量以及K+/Na+(Fig. 3E)、Ca2+/Na+(Fig. S3F)和Mg2+/Na+(Fig.
3G)比例在GN和AG中均有所降低。尽管如此，与AG相比，GN的Na+含量相对较低(Fig. 3B)，而Ca2+(Fig. 3C)和Mg2+(Fig. 3D)含量则较高，Ca2+/Na+ (Fig. 3F)和Mg2+/Na+(Fig. 3G)比例在GN中保持相对稳定。在碱性条件下，两种品种之间的K+含量(Fig. 3A)和K+/Na+比例(Fig. 3E)没有显著差异。![]()
![]()
3.2 差异表达基因（DEGs）的鉴定与分类
在过滤后，RNA测序的读段被比对到紫花苜蓿基因组上，映射比率在76.80%至78.01%之间(Table S2)。通过比较两种品种（GN和AG）在对照（CGN、CAG）和碱性处理（TGN、TAG）条件下的样本，我们构建了两个比较组：TGN与CGN（622个基因）和TAG与CAG（541个基因）(Fig. S2A)。所有差异表达基因（DEGs）用于转录丰度的层次聚类分析，DEGs的热图显示在碱性胁迫下，GN和AG中特定和共同基因的表达水平均有所增加或减少(Fig. S5 and Table S3)。随后，我们将以上两个比较中得到的DEGs分为三类：耐碱性品种GN的碱性应答基因（TAR）、敏感品种AG的碱性应答基因（SAR）以及两种品种共有的基因（CAR，非品种特异性）。这些DEGs的文氏图显示，有48个CAR基因对碱性胁迫做出了响应(Fig. S2B)；在两种品种中，有16个基因共同上调，20个基因共同下调(Fig. S2B and Table S4)。有五个基因在GN中上调而在AG中下调(Fig. S2B)，还有七个基因在GN中下调而在AG中上调(Fig. S2B and Table S4)。此外，GN中特异性上调和下调的TAR基因分别为367个和207个（共574个），而AG中特异性上调和下调的SAR基因分别为266个和227个（共493个）(Fig. S2B and Table S4)。3.3差异表达基因对碱胁迫的GO与KEGG富集分析
对差异表达基因（DEGs）进行GO富集分析，以分配功能信息。在48个CAR基因中，有27个被分配到19个GO术语，其中包括5个细胞组分（CC）、3个分子功能（MF）和11个生物过程（BP）(Fig. S3A)。对于TAR基因，574个中有311个被分配到37个GO术语，汇总为3个主要GO类别，包括12个细胞组分（CC）、7个分子功能（MF）和18个生物过程（BP）(Fig. S3B)。对于SAR基因，493个中有260个被分配到33个GO术语，包括10个细胞组分（CC）、5个分子功能（MF）和18个生物过程（BP）(Fig. S3C)。在CC类别中，TAR、SAR和CAR基因中最富集的GO术语分别为细胞、细胞部分和膜与细胞器。在MF类别中，主要的GO术语为催化活性和结合活性以及运输活性，适用于TAR和SAR基因，而CAR基因的主要术语为催化活性、结合活性和核酸结合转录因子活性；在BP类别中，三个DEG类别（TAR、SAR和CAR）均表现出代谢过程、细胞过程和单生物体过程。为了进一步探讨差异表达基因（DEGs）对碱性胁迫的潜在功能，进行了KEGG富集分析。在此次分析中，来自CAR、TAR和SAR的11、110和116个DEGs分别被分类为22、91和77个功能类别(Table S5)。根据P值小于0.05的标准，CAR中显著富集的三条KEGG通路为嘧啶代谢（两个基因）、烟酸及烟酰胺代谢（一个基因）和植物-病原体相互作用（三个基因）(Fig.
S4A and Table S5)。在TAR中，显著富集的六条KEGG通路分别为次生代谢物的生物合成（47个基因）、黄酮生物合成（八个基因）、代谢通路（55个基因）、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成（三个基因）、植物的生物钟（五个基因）和植物的MAPK信号通路（九个基因）(Fig. S4B and Table S5)。在SAR中，显著富集的六条KEGG通路分别为次生代谢物的生物合成（44个基因）、甘油磷脂代谢（九个基因）、代谢通路（56个基因）、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（五个基因）、α-亚麻酸代谢（四个基因）和甘油脂代谢（五个基因）(Fig.
S4C and Table S5)。总共识别出GN特异性的27条通路和AG特异性的13条通路(Table S5)。其中，涉及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成的通路（三个基因）、C5支链二元酸代谢（两个基因）、赖氨酸降解（四个基因）、泛酸和辅酶A生物合成（三个基因）、赖氨酸生物合成（两个基因）以及精氨酸和脯氨酸代谢（四个基因）在GN中显著富集（P<0.05）。而维生素B6代谢（两个基因）则在AG中显著富集（P<0.05）(Table
S5)。![]()
![]()
![]()
![]()
3.4 CAR，TAR和SAR核心碱反应基因的鉴定
如Table
1所示，五个CAR基因（MS.gene60267.t1、MS.gene021035.t1、MS.gene026390.t1、MS.gene45510.t1和MS.gene81671.t1）在GN中显著上调，而在AG中下调。其中，只有两个基因有通路注释：MS.gene021035.t1编码的3-酮酰基-CoA合酶（KCS）同时映射到多个不同的通路，包括代谢通路、次生代谢物的生物合成、植物-病原体相互作用和脂肪酸延伸；MS.gene026390.t1编码的长链酰基-CoA合成酶（ACSL）同时映射到其他通路，包括脂肪酸降解、脂肪酸生物合成、脂肪酸代谢和过氧化物代谢(Table 1)。相反，七个CAR基因（MS.gene065904.t1、MS.gene65352.t1、MS.gene88914.t1、MS.gene068618.t1、MS.gene031323.t1、MS.gene47982.t1和MS.gene024840.t1）在GN中显著下调，而在AG中上调(Table 1)。在这些基因中，只有三个基因有通路注释：MS.gene024840.t1编码的12-氧基植物二烯酸还原酶（OPR）与代谢通路相关；MS.gene068618.t1编码的肉桂醇脱氢酶（CAD）与酚丙烷代谢相关，而MS.gene031323.t1编码的复制因子A1（RFA1）同时与DNA复制和修复通路相关，包括错配修复、DNA复制、核苷酸切除修复和同源重组(Table 1)。由于GN对碱性胁迫的耐受性高于AG(Fig. 1)，我们假设在GN中映射到显著富集类别或特定富集的差异表达基因（DEGs）可能与紫花苜蓿的碱性耐受表型相关。在本研究中，共有九个TAR基因在植物MAPK信号通路中显著富集(Table 2)。其中，脱落酸受体（PYL，MS.gene32980.t1）、病理相关蛋白1（PR1，MS.gene02249.t1）和转录因子MYC2（MS.gene060503.t1）在GN中显著上调。相反，编码钙调素（CALM，MS.gene070637.t1、MS.gene073306.t1、MS.gene86455.t1）、WRKY转录因子33（WRKY33，MS.gene24960.t1）、乙烯受体（ETR，MS.gene025978.t1）和乙烯生物合成酶1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶1/2/6（ACS 1_2_6，MS.gene023978.t1）的三个基因在GN中显著下调(Table 2)。与TAR相比，只有四个SAR基因映射到植物MAPK信号通路。其中两个基因为LRR受体样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶FLS2（FLS2，MS.gene002602.t1、MS.gene002602.t1）、一个为乙烯响应转录因子1（ERF1，MS.gene49293.t1）、一个为MAP激酶底物1（MKS1，MS.gene02674.t1），这些基因在AG中碱性条件下均显著下调(Table 2)。此外，共有八个TAR基因在黄酮生物合成中显著富集(Table 3)。涉及黄酮生物合成的两个基因为查尔酮合酶（CHS，MS.gene024293.t1、MS.gene09285.t1）显著上调，而另外三个CHS基因（MS.gene050883.t1、MS.gene88887.t1、MS.gene88888.t1）在GN中显著下调(Table 3)。值得注意的是，这五个CHS基因也被归类为植物昼夜节律相关基因(Table
4)。此外，一个黄酮醇合成酶（FLS，MS.gene053758.t1）和两个黄酮3′-单羟基化酶（CYP75B1，MS.gene044441.t1、MS.gene79428.t1）在GN中显著上调(Table 3)。在AG中，三个SAR基因在黄酮生物合成中显著富集：一个为花青素合成酶（ANS，MS.gene20359.t1）和一个双功能二氢黄酮醇4-还原酶/黄烷酮4-还原酶（DFR，MS.gene27250.t1）显著上调，而第三个基因编码与黄酮生物合成相关的香豆酸O-羟基肉桂酰转移酶（HCT，MS.gene90374.t1）显著下调(Table 3)。此外，一个与植物昼夜节律相关的基因GIGANTEA（GI，MS.gene88890.t1）在AG中显著下调(Table S6)。在TAR基因中，有两个基因编码乙酰乳酸合酶（ALS，MS.gene06222.t1和MS.gene38605.t1）和一个编码二羟基酸脱水酶（DHAD，MS.gene35759.t1）的基因被识别并映射到缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成中(Table S7)，在GN中显著上调。两个SAR基因编码与维生素B6代谢相关的吡哆醛磷酸酶（PHOSPHO2，MS.gene069913.t1和MS.gene072128.t1）在AG中上调(Table S8)。4 讨论
4.1碱胁迫下的生理调节
品种AG比GN对碱性胁迫更敏感，表现为地上部鲜重和叶片叶绿素含量的减少(Fig. 1C, D)，表明紫花苜蓿的碱性耐受性与品种的遗传特性有关。丙二醛（MDA）反映膜脂过氧化程度，通常用于指示氧化胁迫的程度。碱性胁迫会导致植物中过量活性氧（ROS）的积累，从而通过氧化胁迫导致细胞损伤甚至死亡。与此同时，碱性胁迫还可以诱导抗氧化活性的增加。在本研究中，GN中的MDA含量显著低于AG (Fig. S1-B)，并且与AG相比，GN促进了过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性(Fig. 2C, D)，表明紫花苜蓿可以通过在碱性条件下增加这些抗氧化酶的活性来保持ROS的生成和清除的平衡。高盐浓度由于膜去极化和Na离子的置换导致K和Ca的流失。碱性溶液中的大量Na+会扰乱植物的离子稳态。此外，根际较高的pH环境导致Ca2+和Mg2+沉淀（Ca2CO3和Mg2CO3），进一步造成养分失衡。数据显示，与适宜条件相比，碱性胁迫下GN和AG地上部的K+、Ca2+和Mg2+含量显著降低(Fig. 3)。有趣的是，GN在碱性胁迫下维持了更高的Ca2+和Mg2+积累，且地上部中这些离子与Na+的比例也高于AG。这与最近的研究结果一致，即钙对维持植物膜的结构和功能完整性至关重要，并在调节离子转运、选择性、信号转导、细胞壁酶和抗氧化酶活性方面发挥重要作用。基于上述结果，推测碱性处理植物的Ca2+水平暂时升高可能会激活植物的碱性信号通路，并参与调控对碱性胁迫响应的抗胁迫基因的表达。同样，Mg2+不仅对蛋白质合成和叶绿素结构是必要的，还参与维持离子稳态、促进信号传导和在应对盐碱胁迫中激活酶活性。脯氨酸和可溶性糖通过渗透调节参与植物的生理响应。在本研究中，GN在碱性胁迫下积累了更多的可溶性糖和脯氨酸(Fig. 2A, B)。这与先前的研究一致，表明过量积累脯氨酸可以显著提高植物对碱性胁迫的耐受性。然而，碱性胁迫在GN中诱导了略高于AG的可溶性糖含量，这可能归因于品种差异或碱性胁迫强度导致糖积累的变化。4.2 与细胞壁和膜保护相关的核心碱性响应基因
如前所述，木质素的单体通过酚丙烷途径合成，而CAD是木质素生物合成的关键酶。木质素为植物次生细胞壁提供机械强度（抗压能力）和防水性，不仅保护细胞免受非生物胁迫，还作为应对环境胁迫的结构。木质素下调可能导致紫花苜蓿的固有防御反应表达。与此一致，我们的研究表明，编码CAD的一个CAR基因（MS.gene068618.t1）在GN中下调，而在AG中上调(Table 1)，这表明细胞壁损伤和成分变化对碱性胁迫的反应可能是碱性感应机制，进而触发植物对碱性胁迫的反应。脂肪酸作为分子成分或单独作用，在细胞膜、能量代谢和信号传导中具有多种功能。它们还通过重塑膜流动性和防止ROS的积累或过量产生，促进可诱导的胁迫抵抗。本研究的转录组数据显示，两个CAR基因，ACSL（MS.gene026390.t1）和KCS（MS.gene021035.t1），参与脂肪酸延伸、脂肪酸降解、脂肪酸生物合成和脂肪酸代谢，在GN中显著上调，而在AG中下调(Table 1, Fig. 4)。在盐胁迫条件下，类似的结果也在水稻和高粱中报告过。这些发现可能表明，耐胁迫的品种通过上调参与脂质代谢的基因，能够更好地保护细胞膜免受各种胁迫的损伤。4.3 与DNA复制和修复相关的核心碱性反应基因
细胞通过激活强大的DNA损伤反应（DDR）通路来应对DNA损伤，为特定的DNA修复提供足够的时间，以化学方式去除底物依赖性损伤。迄今为止，已经报告了五条DDR通路：碱基切除修复（BER）、核苷酸切除修复（NER）、错配修复（MMR）、同源重组修复（HR）和非同源末端连接（NHEJ）。研究表明，盐胁迫会影响参与DNA复制的细胞过程。本研究观察到，参与DNA复制、错配修复、核苷酸切除修复和同源重组的CAR基因（MS.gene031323.t1）在GN中下调，而在AG中显著上调(Table 1, Fig. 4)。然而，这与在甜菜中发现的DNA复制通路对高中性盐胁迫的特异反应而非高盐碱水平的研究结果不一致。无论是耐盐还是敏感的紫花苜蓿，参与DNA复制和修复通路的基因表达均存在差异。5 主要结论
与AG相比，GN品种在碱性胁迫下表现出相对较高的耐受性，这表现在其更高的叶绿素含量和更大的茎鲜重。对两种品种之间差异表达基因（DEGs）的GO分类和KEGG通路的比较分析显示，CAR基因主要涉及酚丙烷生物合成、脂质代谢以及DNA复制和修复；TAR基因在代谢通路中显著富集，包括氨基酸和次生代谢物（如类黄酮）的生物合成，以及MAPK信号通路；而SAR基因则专门富集在维生素B6代谢中。对这些通路及相关核心基因的进一步研究将有助于更好地理解碱性耐受性的遗传基础，从而促进在受盐碱影响的土地上改良紫花苜蓿品种，实现更高效和可持续的生产。Reference:
Wei T J, Li G, Wang M M, et al. Physiological and transcriptomic analyses
reveal novel insights into the cultivar-specific response to alkaline stress in
alfalfa (Medicago sativa L.)[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2021,
228: 113017.
https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2021.113017
本期分享来自2023级农艺与种业专业硕士研究生何小聪
