摘要：青椒果实在低温贮藏过程中会发生冷害，导致果实品质显著下降。本研究利用生理学、转录组学和代谢组学分析来确定胰蛋白酶在4℃储存8天的青椒中减轻CI的机制，随后是3天的保质期。结果表明，胰蛋白酶处理显著降低了辣椒的电解质泄漏和CI指数，有效延长了青椒的保质期，保持了采后品质。贮藏4 d后，比较组学分析鉴定出胰蛋白酶处理与对照处理组青椒之间存在2514个差异表达基因(DEGs)和397个差异丰富代谢物(DAMs)。胰蛋白酶处理引起糖代谢的改变，调节HK、SUS、INV和GLGC的表达，从而影响代谢产物如CDP-葡萄糖和α-D-p-葡萄糖的丰度。胰蛋白酶还能促进类胡萝卜素代谢，从而调节Rhodopinal葡萄糖苷、Farnesy1-PP和1'Hydroxy-y-胡萝卜素葡萄糖苷的的丰度，影响PDS、CRTH、CRTB和LUT5的表达。在MAPK通路中FLS2、ELF18、PTO、PR1、PTI5、WPKY、MEKK1和MPK6基因的差异表达与缓解青椒冷藏期CI有关。综上所述，胰蛋白酶是缓解青椒冷藏期CI的有效手段。
关键词：胰蛋白酶；青椒(Capsicum annuum L)
文 章 信 息
译名：对胰蛋白酶介导的青椒果实免于冷害的生理和组学综合分析
发表时间：2024年07月26日
期刊IF：8.5（2024）
第一单位：农业农村部蔬菜采后加工重点实验室
通讯单位：农业农村部蔬菜采后加工重点实验室
文 章 亮 点
1.低温贮藏可以抑制青椒果实的呼吸作用，延缓采后老化，延长其贮藏寿命。然而，青椒是一种对冷敏感的蔬菜，这使得它们在7℃以下储存时容易受到冷害(CI)。
2.胰蛋白酶处理激活了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径，该途径在非生物胁迫的信号转导中起着不可或缺的作用。
文 章 简 介
1 研究意义
低温储存被认为是延长水果和蔬菜保质期的最有效方法之一，因为它可以显著延缓它们的衰老。青椒(Capsicum annuum L)属于茄科茄子亚科，因其高营养价值而被公认。低温贮藏可以抑制青椒果实的呼吸作用，延缓采后老化，延长其贮藏寿命。然而，青椒是一种对冷敏感的蔬菜，这使得它们在7℃以下储存时容易受到冷害(CI)。CI的症状包括水分流失(脱水)和表面组织腐烂，这降低了它们的销路，并导致重大的经济损失。目前，采用防腐处理和严格的贮藏温度调节来防止青椒CI，延长其贮藏期，同时不降低其感官品质评级。因此，本研究旨在研究胰蛋白酶对低温贮藏青椒果实CI的影响，并全面分析青椒果实对胰蛋白酶的分子响应。
2 研究方法
2.1植物材料
本研究选择的青椒果实采自中国延庆县东小营村，收获后2小时内及时运至实验室。随机分为两组，每组大约360个青椒果实。用0.8 g/L胰蛋白酶溶液浸泡青椒果实，风干，然后放入0.03 mm PE袋(每袋20个青椒)，在4℃下储存。等量的青椒未经处理作为对照(CK)。在贮藏期内，每隔0天、2天、4天、6天和8天随机抽取两组水果，之后将剩余水果转移到20℃的环境中，持续3天，以模拟货架期条件。在每个采样时间点采集两组辣椒果实3个生物重复，每个重复4个果实(共12个果实)。
2.2试验方法
主要涉及的试验方法：CI指数、CI率、叶绿素和维生素C (Vc)含量、丙二醛(MDA)含量，可溶性固体含量(SSC)和硬度、电导率、O2—生成和H2O2含量、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性；代谢组学和转录组学分析；贮藏过程中蔗糖和淀粉的代谢、MAPK通路基因的表达分析、类胡萝卜素生物合成等。
3 研究结果
3.1叶绿素和VC含量
对照组青椒比胰蛋白酶组对低温更敏感，出现CI症状(图1A)。在4℃条件下贮藏4天后，CK组青椒表面出现了轻微的CI症状，而胰蛋白酶处理的青椒没有出现CI症状。4℃贮藏8天后，CK处理组CI症状明显，出现大面积萎缩。相比之下，胰蛋白酶处理组的青椒仍然没有CI症状(图1A)。与胰蛋白酶组相比，CK的CI指数和CI率在贮藏期间明显更高(图1B和C)。4℃贮藏4 d后，CK组CI指数为8.9%，8 d后CI指数提高至20.8%。相比之下，胰蛋白酶样品组在4 d后的CI指数为6.5%。贮藏8 d后，CK组和胰蛋白酶组的CI率分别为10.5%和24%。对照组的CI率大约是胰蛋白酶组的4.38倍。在4℃贮藏下，两组叶绿素含量均有所下降(图1D)。贮藏8 d后，CK组和胰蛋白酶组青椒叶绿素含量分别为0.052和0.058 mg/g。在贮藏和货架期，CK组的叶绿素水平明显低于胰蛋白酶组。在4℃下储存4天后，两组样品的Vc含量普遍下降，特别是在贮藏后期和整个保质期(图1E)。与叶绿素含量一样，在贮藏和货架期内，CK组Vc含量明显低于胰蛋白酶组。贮藏8 d后，CK组和胰蛋白酶组青椒果实Vc含量分别为0.21和0.24 mg/g。
3.2 MDA含量、硬度和SSC含量
两组样品的丙二醛含量在贮存和保质期内均有所增加。但是，与胰蛋白酶组相比，CK中的MDA含量明显升高，表明其CI水平更高(图1F)。贮藏8 d后，CK组和胰蛋白酶组青椒MDA含量分别为0.856和0.815nmol/g。值得注意的是，贮藏3 d后，CK的MDA含量是胰蛋白酶组的1.29倍。在贮藏过程中，两组处理的青椒硬度均有所下降，但胰蛋白酶组青椒硬度下降的速度和总体水平明显较低(图1G)。贮藏4 d后，SSC在贮藏后期呈先上升后下降趋势(图1H)。与前面不同的是，CK组的SSC水平略高于胰蛋白酶组。贮藏8 d后，CK组和胰蛋白酶组的SSC含量分别为3.89%和3.71%。
3.3电导率，O2—生成率和H2O2含量
与胰蛋白酶组比，CK组的电导率迅速增加(图1I)。贮藏8 d后，CK的相对电导率是胰蛋白酶处理组的2.61倍，表明CK组CI水平显著上升。O2—的产生是氧化应激的一个指标，ROS的积累会导致氧化损伤。与电导率一样，在整个贮藏和保质期内，CK组的O2—产量水平明显高于胰蛋白酶组，这表明CI水平明显更高(图1J)。贮藏过程中，两个处理组的H2O2水平均有所上升，但CK处理组的H2O2水平的上升速度和总体水平都远高于胰蛋白酶处理组(图1K)。
3.4 DEGs和DEMs分析
根据FPKM值构建的ClusterGVis图谱，将其表达模式分为四组(图2A)。从表达模式可以看出，C3组中有3919个基因的表达模式是先升高后降低，而C1组中有5790个基因的表达模式则相反(图2A)。青椒贮藏4天后，对两个处理组间鉴定的DEGs进行KEGG通路分析后发现16个DAMs在次生代谢物的生物合成途径中被注释，13个DAMs被注释为ABC转运体，13个被注释为类胡萝卜素的生物合成途径(图2B)。对两个处理组间鉴定的DEGs进行KEGG通路分析，结果表明，碳代谢途径注释了37个DEGs，蔗糖和淀粉代谢途径注释了29个DEGs(图2C)。但值得注意的是，在植物病原体之间的相互作用中注释了86个DEGs(图2C)。青椒贮藏4天后，胰蛋白酶组共鉴定出12980个DEGs，其中6456个DEGs上调，6524个DEGs下调(图2E)。CK 4d vs T 4d共鉴定出2514个基因，其中1045个基因表达上调，1469个基因表达下调(图2D和E)。
3.5贮藏过程中蔗糖和淀粉的代谢
3.5.1贮藏期间与蔗糖和淀粉代谢相关的代谢物的变化
对贮藏0 d和4 d的CK组和胰蛋白酶组青椒进行代谢组学分析，比较中发现了两种DEMs（CDP-葡萄糖、α-D-p-葡萄糖），在贮藏4天后两组中CDP-葡萄糖的相对丰度均下降，而α-D-p-葡萄糖的相对丰度均升高(图3B)。
3.5.2与蔗糖和淀粉代谢相关基因表达的变化
青椒贮藏4天后，胰蛋白酶处理组蔗糖合成酶(SUS) (gene-Loc107855831)的FPKM值较CK组显著升高(图3C)，并且胰蛋白酶组SUS的FPKM值是CK组的1.71倍。胰蛋白酶组HK (gene-Loc107870788)的FPKM值也明显高于CK组4天样本组(图3D)，FPKM值分别为3.71和6.22。与CK组相比，胰蛋白酶组蔗糖转化酶(INV) (gene-LOC107843684)的FPKM值较高(图3E)。FPKM值分别为3.82和6.31。同样，CK组GLGC (gene-LOC107840421)的FPKM值低于胰蛋白酶组，分别为3.45和6.51(图3F)。最后通过RT-qPCR分析基因相对表达对FPKM数据进行验证(图3 G-J)，其结果表明RT-qPCR结果与FPKM数据相似，贮藏4天后的青椒，在胰蛋白酶组中基因的相对表达量均高于CK。这些结果证实了RNA-seq数据和相关FPKM值的可靠性。
3.6 MAPK通路基因的表达分析
胰蛋白酶组中植物受体(FLS2) (capsicum- num -new-gene-10105)的FPKM值显著高于CK组(图4B)，其FPKM值分别为6.96和13.66。青椒贮藏4天后，FLS2 (gene-Loc107843030)和ELF18 (gene-LOC107873711)在胰蛋白酶组的FPKM值高于CK组(图4C和D)。MEKK1 (gene-LOC107878300)的FPKM值也是如此(图4E)。相比之下，MPK6 (gene-LOC107855563)、BAK1 (gene-LOC107867893)和PTO (gene-LOC107842405)的FPKM值在胰蛋白酶组中贮藏4天后低于CK组(图4F、G和K)。PR1 (gene-LOC107877494)在胰蛋白酶组中的表达量是CK组的2.23倍(图4I)。在胰蛋白酶组中PTI5的表达量是CK组的1.27倍(图4J)。WPKY在胰蛋白酶组和CK组贮藏4天后的表达量分别是是14.86和9.86，说明WPKY的表达受胰蛋白酶调节(图4L)。在胰蛋白酶组青椒果实中，FLS2和WPKY22的相对表达量是CK组的1.87和2.16倍(图4N和O)，BAK1和ELF18的相对表达量分别是CK组的0.69和0.76倍(图4P和Q)，PTI5和PTO的相对表达量分别是CK组的1.26和0.39倍(图4I和S)，MPK6和MEKK1的相对表达量分别是CK组的3.39和0.38倍(图4T和U)。
3.7类胡萝卜素生物合成
3.7.1与类胡萝卜素生物合成相关的代谢物的变化
对贮藏0 d和4 d的胰蛋白酶处理组和CK处理组青椒进行代谢组学分析，确定了三种DEMs（Rhodopinal葡萄糖苷、1'Hydroxy-y-胡萝卜素葡萄糖苷和Farnesy1-PP）。青椒果实贮藏4天后，两处理组Rhodopinal葡萄糖苷和Farnesy1-PP的相对丰度均下降，而1'Hydroxy-y-胡萝卜素葡萄糖苷的相对丰度上升(图5B)。
3.7.2与类胡萝卜素生物合成相关基因表达的变化
FPKM数据显示，青椒果实在低温下贮藏4 d后与类胡萝卜素生物合成相关的基因均在胰蛋白酶组表达较高(图5 C-F)。PDS (gene-LOC107859820)、CRTH (geneLOC107848237)的表达量分别是CK组的1.65倍和1.88倍。CRTB(gene-LOC107868281)的表达量为7.23，是CK组的1.57倍；LUT5 (gene-LOC107850957)的表达量为2.36，是CK组的0.55倍。其中在青椒贮藏4 d后胰蛋白酶组PDS和CRTH的相对表达量分别是CK组的1.73和1.22倍(图5G和H)；CRTB和LUT5的表达量分别是CK组的1.16和2.39倍(图5I和J)。
4 讨论
在4℃贮藏过程中，青椒果实的组织结构和营养成分逐渐退化，说明对寒冷敏感水果会出现这种症状（CI）。果实的硬度是影响采后质量的重要指标。研究表明，低温冷藏导致膜脂从液晶状态转变为凝胶状态，增加了电解质泄漏。但在本研究中，经过胰蛋白酶处理的青椒，其硬度提高，电解质泄漏降低，表明胰蛋白酶处理有助于维持果实的采后品质。
低温胁迫导致细胞膜脂质过氧化，损害细胞完整性，活性氧（ROS）水平显著增加。SOD等酶类有助于清除自由基以维持ROS代谢平衡，类胡萝卜素能够清除活性氧，并在植物抗氧化防御系统中发挥重要作用。有研究也表明，类胡萝卜素在低温反应及耐受性中至关重要。在本研究中，我们发现类胡萝卜素生物合成途径中的关键基因在胰蛋白酶处理的青椒中上调，相关代谢物的丰度变化也说明了其对贮藏品质的调控作用，为进一步维持青椒果实的采后品质奠定基础。
本研究探讨了糖代谢、MAPK通路与类胡萝卜素生物合成与胰蛋白酶处理和CK组青椒果实贮藏品质的关联，结果表明这三者共同作用于青椒果实在低温贮藏期间的品质维持，对其减轻低温贮藏期间的CI起了显著作用，从而强调了胰蛋白酶诱导的代谢调控的重要性(图6)。
5结论
研究结果表明，冷藏前用胰蛋白酶处理的青椒果实CI发生率较低，采摘后品质比对照(CK)的青椒好。经胰蛋白酶处理后青椒Vc、叶绿素含量和硬度均高于对照。胰蛋白酶处理组青椒的MDA含量和相对电导率均低于CK组，表明CI水平较低。此外，通过代谢组学和转录组学数据表明胰蛋白酶对糖代谢、MAPK通路和类胡萝卜素代谢的调节有益，说明胰蛋白酶处理在维持青椒冷藏期间的采后品质方面发挥着重要作用，为进一步了解胰蛋白酶对青椒果实的基因调控网络提供了新的见解。
Reference：
Keyan Zhao, Xuanqi Wang, Xiaozhen Yue, Jieyu Lv, Xiaodi Xu, Hongshan Lu, Jinhua Zuo, Xiangbin Xu, Bin Chen, Shuzhi Yuan, Qing Wang. A comprehensive physiological and -Omic analysis of trypsin-mediated protection of green pepper fruits from chilling injury. Food Chemistry, 2024, 460, 140547.
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2024.140547
本期分享来自2024级草学专业硕士研究生刘月
