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摘要：E74是蜕皮激素诱导的转录因子之一，参与了昆虫生长发育的许多生理过程，但其在棉铃虫中的作用尚不明确。本研究首次在棉铃虫中鉴定到E74的一个亚型E74B。通过生物信息学分析表明，棉铃虫E74B与家蚕E74B同源性最高，属于E26转化特异性（ETS）超家族。表达谱显示，HaE74B的转录水平在4-6龄后期较早期升高；在蛹和中肠中转录水平也较高。此外，我们还通过RNA干扰和20E拯救实验研究了HaE74B的功能。结果表明，E74B的沉默影响了幼虫的蜕皮和生长，导致60%以上的幼虫死亡。此外，它还严重影响了棉铃虫的变态，降低了棉铃虫的化蛹率、羽化率和繁殖力。20E在一定程度上恢复了棉铃虫在蜕皮、发育和化蛹的缺陷。
关键词：棉铃虫；HaE74B；发育与变态
文 章 信 息
译名：沉默E74B基因对棉铃虫发育和变态的影响
发表时间：2023年11月
期刊影响因子：3.8（2023）
第一单位：新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源与基因工程重点实验室
通讯单位：新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源与基因工程重点实验室文 章 亮 点
1.首次在棉铃虫中鉴定到E74的一个亚型E74B。
2.qRT-PCR检测了E74B在棉铃虫不同组织和发育阶段的表达模式。
3.通过RNAi和20E拯救实验研究了E74B基因在棉铃虫发育和变态过程中的功能。
文 章 内 容
1 研究意义
棉铃虫Helicoverpa
armigera（Lepidoptera）是一种毁灭性的多食性农业害虫。棉铃虫对Bt棉的田间抗性逐渐增强且化学物质的滥用对环境造成了负面影响，并对非靶标昆虫造成了毒性。昆虫的蜕皮主要由蜕皮激素（20E）和保幼激素（JH）介导。E74为蜕皮激素的重要转录因子，E74A和E74B基因调控昆虫的多种生物过程，影响昆虫的生长发育。然而，转录因子E74如何影响棉铃虫的生长发育过程尚不明确。研究E74B在棉铃虫生长发育的作用，最终有助于新型、高效、绿色的防治技术研发。2 研究方法
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3 研究结果
3.1棉铃虫HaE74B基因的序列分析
棉蚜HaE74B的ORF全长序列为1260
bp，编码419个氨基酸，预测分子量为46.2
kDa，理论等电点（pI）为8.70。该蛋白的氨基酸组成成分最常见的是丙氨酸（Ala）和脯氨酸（Pro），分别占10.5%，其次是亮氨酸（Leu），占8.8%，然后是丝氨酸（Ser），占8.1%。保守ETS结构域为234-404个氨基酸。在棉铃虫中，E74B基因的ETS结构域与其他昆虫中的E74B基因高度保守（Fig.
1A）。此外，系统发育分析显示，HaE74B基因与家蚕亲缘关系密切，同源性为85.71%（Fig.
1B）。![]()
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3.2棉铃虫HaE74B基因在不同发育阶段和不同组织中的表达谱
HaE74B表达水平相对在幼虫的不同发育阶段较低，在蛹前和蛹期相对较高。HaE74B在蛹期表达最高（Fig. 2A）。在同一龄期，HaE74B的晚期表达水平显著升高。随着龄期的增长，HaE74B基因的表达水平整体呈上升趋势（Fig. 2B）。在检测的不同组织中，HaE74B在中肠的表达水平相对较高（Fig. 2C）。
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3.3合成dsRNA的鉴定
针对克隆得到的HaE74B基因的正确序列，设计了两个干扰片段（Fig.
3A）。合成的dsGFP（Fig.
3B）、dsF1（Fig.
3C）和dsF2（Fig.
3D）片段通过1%凝胶电泳检测。结果显示，经Rnase酶切后的条带为单条带，表明可用于后续实验。![]()
3.4沉默E74B对棉铃虫幼虫生长的影响
注射dsF1后24
h，E74B的相对表达量比CK和dsGFP降低了58.8%，注射dsF1和dsF2后48
h，E74B的相对表达量分别比对照降低了67.7%和76.5%（Fig.
4A）。dsF1和dsF2处理后的棉蚜体长（Fig.
4B）和体重（Fig.
4C）明显小于CK和dsGFP处理后的棉蚜幼虫（Fig.
5A），幼虫发育迟缓。此外，用dsF1和dsF2处理后，棉蚜幼虫（Fig.
4D）的蜕皮延迟超过12小时（Fig.
5B）。dsF1和dsF2处理后的幼虫累积死亡率分别为64%和68%（Fig.
4E），11%和17%的幼虫因无法完成蜕皮而死亡（Fig.
5C）。![]()
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3.5沉默E74B对棉铃虫蛹-成虫的影响
dsF1和dsF2处理后，与CK和dsGFP处理相比，棉铃虫的蛹率显著降低（Fig.
6A）。经dsF1和dsF2处理后，蛹腹部中部比对照组大，最终导致蛹死亡。部分变形的蛹仍不能完全蜕去幼虫被膜（Fig.
6B）。RNAi也会影响羽化。dsF1处理的蛹羽化率显著低于CK和dsGFP处理的蛹羽化率（Fig.
6C）。一部分无法完成变形，另一部分存在翅缺陷（Fig.
6D）。dsF1和dsF2处理后的产卵量显著低于对照组（Fig.
6E）。![]()
3.6
20E拯救对棉铃虫生长发育的影响
与dsF1处理组相比，棉铃虫的蜕皮率降低。用20E处理后增加了棉铃虫的蜕皮率（Fig.
7A、B）。同时，还测定了注射20E后12、24和36
h棉铃虫的体重。结果表明，20E拯救后，棉铃虫的生长得到缓解（Fig.
7C、D）。观察到20E拯救的棉铃虫的化蛹率与dsF1处理的相比有所增加，表明20E拯救后棉铃虫的变态也得到了部分缓解（Fig.
7E）。![]()
4 讨论
E74具有两个可变剪接异构体（E74A和E74B），其在C端含有一个保守的ETS结构域和一个独特的N端。异构体特异性区域在N端编码不同的氨基酸残基，因此它们在昆虫的生长发育过程中可能发挥不同的作用。在幼虫发育过程中，E74B受低浓度的20E诱导，优先于E74A转录。这表明E74的两种异构体在幼虫-幼虫发育和幼虫-成虫变态过程中发挥不同的功能。在本研究中，我们根据转录组数据克隆了棉铃虫E74B基因。我们发现其C端含有一个保守的ETS结构域，属于EST家族蛋白，产生稳定的蛋白片段，足以与DNA结合。系统进化分析表明，HaE74B基因与家蚕的亲缘关系最近，其次是烟草天蛾。本研究结果显示，HaE74B在幼虫期表达量较低，在预蛹期和蛹期表达量较高。表明E74B可能在幼虫-蛹-成虫的变态发育过程中起着不可或缺的作用。此外，我们还测定了HaE74B基因在4-6龄前期和后期的转录水平。结果表明，该基因在各龄期前期转录水平较低，后期转录水平迅速上升，可能与20E的分泌有关。20E的分泌量在蜕皮和变态前先增加后减少，引发幼虫-幼虫和幼虫-成虫的发育转变。这些结果表明E74B与20E协同参与昆虫生长发育。近年来，RNAi被广泛用作研究基因功能的工具，在开发新型害虫管理策略方面具有巨大的潜力。本研究通过RNAi阐明了HaE74B基因在棉铃虫生长发育和变态中的功能。结果表明，RNAi介导的HaE74B沉默显著影响了幼虫的生长发育。20E拯救能部分缓解dsHaE74B对幼虫的不利影响。此外，与RNAi组相比，20E挽救后棉铃虫的化蛹率增加。20E拯救也缓解了E74B沉默后棉铃虫的一些缺陷。同时，棉铃虫的生长和变态也得到部分缓解。这些结果表明，E74B基因在昆虫的生长发育中起着至关重要的作用。综上，E74B基因除了作为20E的关键初级响应基因发挥作用外，还作为晚期基因转录的有效阻遏物，通过直接作用于20E发挥核心作用，从而调控昆虫的生长发育过程。5 主要结论
本研究首次克隆并报道了E74B基因，qRT-PCR结果显示其在棉铃虫不同组织和发育阶段均有表达。通过RNAi和20E拯救实验研究了E74B基因在棉铃虫发育和变态过程中的功能。E74B基因可作为害虫防治的分子靶标。本研究结果为基于RNAi的棉铃虫绿色管理提供了新的见解。Reference：
Xu X , Li T ,
Zhang L ,et al.Effect of silencing the E74B gene on the development and
metamorphosis of Helicoverpa armigera[J].Pest Management Science, 2024（3）:80.
https://doi.org/10.1002/ps.7874
本期分享来自2024级草学专业硕士研究生李忠意
