摘要：该研究通过纳米载体递送双链RNA（dsRNA），控制破坏性入侵害虫番茄潜叶蛾Tuta absoluta，探讨了一种环保的害虫防治方法。研究发现，壳聚糖（CS）和星型阳离子聚合物（SPc）能够有效结合dsRNA，形成稳定的纳米复合物，粒径分别为59±23 nm和67±24 nm。纳米材料有效保护dsRNA免受核酸酶降解，并显著提高了其在植物叶片和昆虫体内的吸收效率。通过喷洒或浸泡处理，dsRNA能够有效渗透到昆虫体内，导致幼虫的蛹重和成虫率显著下降。此外，安全性分析表明，所选目标基因对非靶标生物（如捕食性天敌烟盲蝽）没有显著影响，表明该方法在环境中是安全的。研究结果为可持续农业提供了一种绿色、安全且高效的害虫管理新方法，强调了纳米材料在农业中的应用前景。
关键词：纳米材料；番茄潜叶蛾；RNAi
文 章 信 息
译名：一种前景较好的环境友好型害虫治理方案：纳米载体递送dsRNA用于防治破坏性入侵害虫番茄潜叶蛾
发表时间：2023年2月
期刊影响因子：5.8（2023）
第一单位：中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室
通讯单位：中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室
文 章 亮 点
1.通过纳米载体有效传递双链RNA（dsRNA）以控制破坏性入侵害虫番茄潜叶蛾。
2.确定了纳米载体壳聚糖（CS）与dsRNA最佳结合比例。
3.进行了RNAi防治的安全性分析，对非靶标生物无显著影响。
1 研究意义
RNAi具有高度的特异性和准确性，同时易于降解、环保性高，是控制害虫、避免化学农药过度使用的潜在有效方法。由于dsRNA带负电荷且不亲水，因此其传递和摄取效率较低，同时也容易被核酸酶降解。所以昆虫（尤其是鳞翅目、半翅目和双翅目）的RNAi效率较低。该研究针对番茄主要害虫番茄潜叶蛾，探索了纳米材料介导的RNAi防治潜力，为基于RNAi的害虫防治提供一种简单、有效的策略。
2 研究方法
3 研究结果
3.1纳米材料与dsRNA的结合
电泳条带的亮度和分布表明，dsRNA与CS的质量比为12.5:1时，融合效果最佳，质量比为50:1、100:1或125:1时，dsRNA在条带中消散，这是因为CS浓度过低，无法与dsRNA充分结合。dsRNA与SPc的质量比为1:1时，二者完全结合（ESI† Fig. S1、S2）。
3.2 dsRNA/纳米颗粒复合物的形态表征
TEM形态学表征。dsRNA形成一个链（Fig. 2A），而CS形成一个块（Fig. 2B）。dsRNA与CS混合后，dsRNA分支与CS完全结合（Fig. 2C），呈现球形分布，平均粒径为59±23 nm。SPc是雪花形状。当dsRNA与SPc结合时，它们形成均匀的球体，平均粒径为67±24 nm（Fig. 2E）。
SEM形态学表征。SEM显示分叉的dsRNA（Fig. 3A）和块状CS（Fig. 3B）。当两者结合时，形态和结构发生了显著变化（Fig. 3C）。SPc呈规则的雪花形状（Fig. 3D），与dsRNA混合后通过静电吸引紧密结合在一起（Fig. 3E）。
3.3纳米材料对dsRNA的保护作用
dsRNA会被RNase A快速降解。当CS与dsRNA结合时，它保护dsRNA免受RNase A的降解（Fig. 4A），并且带密度没有显着变化（Fig. 4B）。同样，SPc也结合到dsRNA上，保护dsRNA不被RNase A降解（Fig. 4C/D）。
3.4喷洒或浸泡对植物吸收dsRNA的影响
用梯度法稀释dsRNA，以cDNA为模板构建标准曲线，计算叶片中dsRNA含量（Fig. 5A）。番茄叶片分别采用浸泡或喷洒处理。结果表明，浸泡或喷洒后，dsRNA能有效进入叶片。喷施显著提高了dsRNA叶片吸收效率（Fig. 5B）。
3.5 dsRNA/纳米颗粒复合物对植物吸收dsRNS的影响
喷洒dsRNA、dsRNA/CS或dsRNA/SPc的叶片均含有dsRNA。与SPc结合的dsRNA含量显著高于分离以及与CS结合的dsRNA含量。因此，SPc有利于促进植物叶片对双链RNA的吸收（Fig. 6）。
3.6 dsRNA/纳米颗粒复合物促进了体壁的穿透
对照组几乎不表达荧光信号（Fig. 7）。荧光dsRNA、荧光dsRNA/CS、荧光dsRNA/SPc均有较强的荧光信号，说明dsRNA和dsRNA/纳米颗粒复合物均能有效穿透番茄潜叶蛾。荧光强度分析显示，荧光dsRNA和dsRNA/SPc处理的番茄潜叶蛾总体平均荧光强度显著高于荧光dsRNA/CS处理（Fig. 7E）。
3.7 dsRNA/纳米颗粒复合物对番茄潜叶蛾的影响
喂食dskr-h1/CS和dskr-h1/SPc纳米颗粒复合物24 h后，Takr-h1的表达水平显著降低，分别比对照组低57.9%（dskr-h1/CS）和60.7%（dskr-h1/SPc）（Fig. 8A）。摄食后，dskr-h1/SPc处理平均蛹重、羽化率均显著降低。
3.8 dskr-h1具有较高的生物安全性
分析了dskr-h1在NCBI中核苷酸序列的BLAST结果（ESI†Table S1）。序列比对结果显示，该基因与6种鳞翅目昆虫的序列显著相似，且序列覆盖率仅为5-13%。没有与人类基因组、捕食者或寄生虫匹配。因此，避免了非靶效应和脱靶效应。dsTakr-h1、dsGFP处理与对照组相比，烟盲蝽的存活率无显著差异（ESI†图S3）。因此，外源施用dsTakr-h1可能对烟盲蝽没有致死作用。
4 讨论
凝胶电泳结果显示，dsRNA与壳聚糖（CS）和星形多阳离子（SPc）有效结合。CS纳米颗粒复合物是dsRNA带负电的磷酸基（PO43−）与CS聚合物带正电的氨基（-NH2）相互作用形成的球形复合物，粒径随比例变化而变化。当RNA与CS质量比为12.5:1时，TEM测得纳米颗粒尺寸为59±23 nm。SPc在核心中有四个支链，其中含有叔胺，通过静电、氢键和范德华力稳定结合dsRNA，提高转染效率。TEM显示dsRNA与SPc结合后呈球形紧密聚合在一起，粒径为67±24 nm。由于TEM和SEM成像原理不同，SEM观察的是样品凹凸不平表面的精细结构，而TEM观察的是样品内部的精细结构，因此呈现出不同的形貌特征。SPc的加入可以有效减小分子粒径，使其更有利于昆虫和植物的吸收。对番茄叶片喷洒和浸泡的吸收效果进行了比较，发现两种施用方法都能将dsRNA转移到叶片内部。而喷施后叶片对dsRNA的吸收效率更高，说明dsRNA制剂在田间/温室可能有效。此外，番茄具有全能性，叶片有可能通过浸泡完全吸收dsRNA发育成完整的植株。这可能会促进对番茄潜叶蛾的防治。
通过分析渗透后幼虫体壁中的荧光强度发现，SPc不影响dsRNA的递送。相反，在dsRNA传递过程中加入CS会减弱番茄潜叶蛾的体壁穿透能力。我们得出结论，SPc不影响dsRNA的递送。而在dsRNA递送中加入CS会减弱番茄叶虫对体壁的穿透。可能是因为CS溶液中的酸性物质（如pH值为4.5的乙酸钠）和盐分物质（如硫酸钠）导致幼虫排斥该溶液。
从叶片吸收和虫体壁穿透效率来看，SPc更有利于dsRNA的传递。RNAi介导的害虫防治中一个关键因素是保证dsRNA在传递过程中的稳定性。CS和SPc均起到了成功保护dsRNA免受RNase A降解的作用。dskr-h1/CS和dskr-h1/SPc处理24 h后，RNAi效率显著。dskr-h1/SPc处理对番茄潜叶蛾蛹重、羽化率影响显著。kr-h1基因的致死率不高，可能因为昆虫的生长、发育和存活是由多个基因共同调控的。单基因干扰可能会刺激其他互补途径。为实现对番茄潜叶蛾dsRNA的有效防治，需要筛选更多的关键靶基因，或两个或多个靶基因联合使用。
在设计dsRNA时应注意选择靶基因的区域以确保最小化对非靶标转录物的影响，避免潜在脱靶可能。我们通过选择目标基因的特定区域来设计dsRNA，最小化非目标转录物同源性，以降低非目标和脱靶效应的风险。BLAST序列匹配以及对非靶标生物烟盲蝽饲喂dsRNA，结果初步证明了dsRNA的安全性。此外，纳米颗粒的具有一定生物毒性，大规模使用时须遵循应用指南。
5 主要结论
该研究发现纳米材料SPc和CS能装载dsRNA，防止dsRNA降解，并被植物和昆虫细胞有效吸收。番茄潜叶蛾摄入dskr-h1/CS和dskr-h1/SPc复合物后，其基因表达量显著降低，摄入dskr-h1/SPc复合物导致蛹重和羽化率异常。并对dskr-h1的安全性进行了分析，发现dskr-h1对非靶生物烟盲蝽没有影响。该研究为进一步完善和丰富纳米载体传递体系、为害虫的可持续防治提供了一条有前景的途径。
Reference：
Wang X , Ji S X , Bi S ,et al.A promising approach to an environmentally friendly pest management solution:NanoCarrier-delivered dsRNA towards controlling the destructive invasive pest Tuta absoluta[J].Environmental Science: Nano, 2023, 10, 1003.
https://doi.org/10.1039/d2en01076c
本期分享来自2024级草学专业硕士研究生李忠意
