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摘要：在昆虫中，类固醇激素20-羟基蜕皮酮（20E）诱导变态，而倍半萜保幼激素（JH）拮抗20E信号，以防止幼虫期的早熟变态。然而，对于这两种激素之间的串扰所涉及的机制知之甚少。该研究发现，果蝇幼虫环腺（RG）中JH和20E相互拮抗对方生物合成，JH抑制蜕皮激素合成，20E抑制JH合成，二者作用决定果蝇发育转变，研究提出了二者在昆虫变态调控中相互作用的机制
关键词：保幼激素；蜕皮激素；变态发育
文 章 信 息
译名：保幼激素和20-羟基蜕皮酮在果蝇环腺中的拮抗作用决定了果蝇的发育转变
发表时间：2018年1月
期刊影响因子：9.4（2023）
第一单位：华南师范大学生命科学学院广州市昆虫发育调控与应用研究重点实验室
通讯单位：华南师范大学生命科学学院广州市昆虫发育调控与应用研究重点实验室
文 章 亮 点
1.明确JH和20E合成在果蝇幼虫主要内分泌器官环腺（RG）内相互拮抗
2.提出Kr-h1介导JH-20E相互作用实现抗变态作用的分子机制
·1 研究意义
果蝇的主要发育转变（如幼虫蜕皮、化蛹和成虫变态）由蜕皮激素（20E）脉冲引发，且每个发育转变受保幼激素（JH）协调。在幼虫中期，高JH水平确保20E脉冲仅触发幼虫间蜕皮；在幼虫末期，JH滴度急剧下降，20E脉冲启动变态。JH通过其受体Met和Gce激活Kr-h1表达，Kr-h1作为抗变态因子抑制20E诱导的基因表达。然而，Kr-h1介导JH-20E相互作用以实现抗变态作用的分子机制仍需深入研究。本研究揭示了JH和20E间的拮抗作用如何调控果蝇变态发育过程。·2 研究方法
2.1果蝇培养与基因表达调控
果蝇品系：使用了包括Aug21-Gal4、Jhamt-Gal4等在内的多种转基因果蝇品系，以及从不同资源中心获取的如UAS-Met-RNAi、UAS-gce-RNAi等RNAi品系，并将所有果蝇与野生型w1118杂交以减少遗传背景差异。构建载体与转基因果蝇：利用pUAST载体构建UAS-Kr-h1-V5等表达载体，通过P-元件介导的生殖系转化产生转基因果蝇。2.2组织处理与观察
免疫染色与成像：按标准流程固定和染色解剖组织，使用多种一抗和二抗，用DAPI染核，Rhodamine-phalloidin染肌动蛋白，在共聚焦显微镜下观察。原位杂交：按制造商说明制备地高辛（DIG）标记的RNA探针，对幼虫组织进行杂交、洗涤、孵育和信号放大，最后在共聚焦显微镜下分析。2.3发育过程相关指标检测
发育时间分析：收集果蝇卵，在不同温度下培养，定期记录化蛹情况以分析发育时间。蜕皮激素滴度测定：在多个时间点收集果蝇幼虫，用酶联免疫吸附测定法测量整体蜕皮激素滴度。20E喂食实验：让果蝇产卵后在不同温度下培养幼虫，在特定时间将幼虫转移到含20E 的食物中培养。2.4细胞实验
细胞培养与20E处理：在施耐德培养基中培养果蝇Kc细胞，用Effectene转染细胞，更换含或不含20E的培养基后检测mRNA。实时定量PCR（qRT-PCR）：制备果蝇幼虫或Kc细胞的总RNA，以rp49为内参进行qRT-PCR。·3 结果与讨论
3.1
JH滴度高时，果蝇PG显示高水平的Kr-h1表达量
利用JHRR-LacZ报告基因（kr-h1）和Met-GFP探究表达模式，发现它们在幼虫的脂肪体、唾液腺、PG及成虫中肠祖细胞（AMP）等组织表达（中肠细胞中未检测到），且在PG中高度表达并与Spok共定位（Fig.
1A-B''', S1）。与前人研究结果一致——JH信号转导靶向幼虫组织以抑制20E诱导的程序性细胞死亡以及幼虫-蛹过程中调节成虫器官的形成。JHRR-LacZ在PG中大量表达，而Metgce双突变体的脂肪和PG中几乎检测不到JHRR-LacZ（Fig.
S2A-B'），原位杂交显示该突变体PG中Kr-h1无表达（Fig.
1D-D'），表明JH通过Met和gce调控PG中Kr-h1的表达，进而调节PG中的蜕皮激素合成来控制20E滴度变化。JH通过调节多种组织（如PG）中的基因表达来发挥作用。![]()
3.2敲低Met、gce或Kr-h1对PG触发变态启动的影响
我们试图研究不同靶组织在介导JH作用中的可能作用。JH缺陷型动物Aug21-Gal4；UAS-grim、双突变体Met27gce2.5K和Kr-h1K04411突变体在化蛹前后死亡，发育时间延迟而不是早熟。同时，三种基因型头部均未能进行正常的外翻（Fig.
2A-C）。在PTTH产生神经元、脂肪体、AMP或唾液腺中敲低Met、gce或Kr-h1对发育时间和存活无显著影响（Fig.
S3）。在PG中敲低Met/gce或Kr-h1导致果蝇完全致死、化蛹时头部外翻失败（类似于Aug21-Gal4；UAS-grim的致死表型）、蜕皮激素滴度提前增加及早熟变态（Fig.
1E-F', 2D-H）。与JH缺陷动物、Met/gce双突变体和Kr-h1突变体不同，PG中JH信号的减弱加速了幼虫发育，导致性早熟。组织特异性RNAi结果表明，果蝇PG是介导JH作用的关键靶器官，这与PG中检测到的Kr-h1的高表达水平一致（Fig.
S1）。![]()
3.3
JH抑制PG中蜕皮激素的合成
变态的时间由20E滴度的增加调控。因此，我们检测了JH是否通过抑制PG中蜕皮激素的生物合成，从而阻止蛹的过早化蛹。事实上，PG中Met、gce或Kr-h1的敲低显著诱导了20E滴度的过早增加（Fig.
2H）。20E含量的过早增加很可能是因为Kr-h1的敲低促进了PG中蜕皮激素的合成。检测到了三个Halloween基因（Spok、Dib、Sad）的转录水平以及Spok蛋白水平的增加，以响应PG特异性敲低Met、gce或Kr-h1（Fig.
2I-N′）。与蜕皮激素滴度的增加一致，Met、gce或Kr-h1RNAi的EcR、USP和多个20E初级反应基因（Br-C、E74、E75和E93）在全身的表达升高以及脂肪体中的Br-C蛋白水平升高（Fig.
2I-J, O-R′）。表明JH通常抑制PG中蜕皮激素的合成，以防止过早化蛹。![]()
3.4在PG中过表达Kr-h1会抑制蜕皮激素的生物合成并阻碍变态发育
为补充功能丧失的研究，我们测试了幼虫-蛹过渡前PG特异性Kr-h1过表达是否能够抑制蜕皮激素生物合成。结果表明，PG特异性Kr-h1过表达使果蝇滞育在三龄幼虫期，抑制蜕皮激素生物合成，降低相关基因表达，添加20E后可恢复发育（Fig.
3A-D）。过表达Kr-h1显著抑制PG中Spok、Dib、Sad基因表达，在PG中检测不Spok蛋白，降低EcR、USP及其他20E初级响应基因表达，在脂肪中检测不到Br-C蛋白（Fig.
3E-I'），证明JH通过Kr-h1抑制PG中的蜕皮激素合成以防止变态。前期研究在果蝇PG中鉴定出PTTH和胰岛素样肽（insulin-like
peptide，ILPs）是蜕皮激素生物合成的正调控因子；我们的工作将JH确立为蜕皮激素合成的负调控因子。3.5
PG中的JH信号不影响ILP合成
与先前的研究一致，Aug21-Gal4中的蜕皮激素滴度过早增加；在UAS-grim幼虫中，也观察到Met27gce2.5K和Kr-h1K04411幼虫蜕皮激素滴度的增加（Fig.
S4A）。我们比较了PG中JH信号传导的减弱和整个果蝇中JH信号传导的缺失是否对ILP生物合成产生不同影响，从而对胰岛素/ILP信号传导产生影响（IIS;InR和4E-BP的高表达代表低IIS，反之亦然）。当Met、gce或Kr-h1在PG中被敲低时，ILP1-7、4E-BP和InR的表达没有改变（Fig.
S4B-C）；当JH信号在PG中被消除时，蜕皮激素的合成增强，而ILP生物合成和IIS不受影响，导致性早熟。先前的研究表明在Aug21-Gal4中，InR和4E-BP的表达量增加从而降低了IIS。在Met27gce2.5K中也检测到了类似结果（Fig.
S4D），然而在这个突变体中，ILPs的表达要么增加，要么减少（Fig.
S4D）。在完全没有JH信号传导的情况下，蜕皮激素合成增强，但IIS减少，因此发育时间延迟。此外，除PG外，可能有另一个介导JH信号传导以调节生长速率和发育时间的靶组织。3.6
JH信号通过影响蜕皮激素合成自调节和PG大小来抑制蜕皮激素的合成
蜕皮激素合成与20E信号存在反馈调节，JH可能在蜕皮激素生成自调节水平影响蜕皮激素合成。Kr-h1过表达使PG中EcR-B1和Br-C蛋白水平显著降低（Fig.
3J-M'）。在果蝇Kc细胞中，无论20E是否存在，Kr-h1过表达都直接抑制EcR、Br-C和E75的表达（Fig.
S6）。相反，PG中敲低Met、gce或Kr-h1导致PG中EcR-B1和Br-C蛋白水平增加（Fig.
S5），表明JH信号通过Kr-h1抑制蜕皮激素合成的正反馈调节。Kr-h1过表达显著减小PG大小（Fig.
3F, G', J-O'），降低CycE蛋白水平和细胞大小（Fig.
3N-O, Fig. S7A-C）。PG特异性敲低EcR对PG大小、CycE蛋白水平和细胞大小无影响，但在过表达Kr-h1的PG中敲低EcR会降低这些参数，与单独过表达Kr-h1的效果相似（Fig.
S8）。而Aug21-Gal4；UAS-grim、Met27gce2.5K和Kr-h1KO4411的PG大小正常，PG特异性敲低Met、gce或Kr-h1也不影响PG大小（Fig.
S7D），表明高JH信号以Kr-h1依赖但20E非依赖的方式减小PG大小，进而抑制蜕皮激素合成（Fig.
S7A-C）。3.7
20E阻遏咽侧体（CA）合成JH以允许变态
在证明JH抑制PG中的蜕皮激素合成后，我们继续研究20E是否与其它昆虫类似，靶向CA以调节果蝇中的JH生物合成。使用Jhamt-Gal4（其在CA中有更特异性表达）与UAS-EcR-RNAi杂交，特异性降低CA中EcR表达（Fig.
S9C-D'）。结果发现，CA特异性敲低EcR导致蛹期完全致死，延迟化蛹约24
h（Fig.
4A-B, E）。增加JH合成关键酶基因（JHAMT和 HMGCR）mRNA 水平、JHAMT蛋白水平中JHRR-LacZ（Kr-h1）的表达水平（Fig.
4G-J'）。在CA中敲除EcR导致三龄幼虫在48
h内，与PG中Kr-h1过表达引起的表型变化相似但比Kr-h1过表达引起的表型变化弱（Fig.
3）。敲低CA中的Jhamt部分挽救了敲低EcR引起的致死性（Fig.
4C-C'），这有力地支持了在CA中敲低EcR后JH升高阻止果蝇正常发育的结论。与此一致的是，Jhamt
RNAi拯救了CA特异性EcR
RNAi引起的蜕皮激素低滴度和20E信号传导（Fig.
S10）。这些结果表明，在CA中阻断20E信号传导，促进JH合成，进而增强PG中的JH信号传导，从而抑制蜕皮激素合成和20E诱导的变态过程。本研究证明了20E是调节果蝇JH生物合成的细胞外信号。 为了确认升高的JH合成是否足以阻断20E信号传导，将Jhamt-Gal4与UAS-Jhamt杂交。在CA中过表达Jhamt以促进JH合成和JH信号传导，导致蛹期完全致死（Fig.
4D, Fig. S11）。这些结果表明，果蝇利用20E信号来阻止CA中的JH生物合成，以便PG产生足够的蜕皮激素以确保变态的发生。
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3.8
RG中20E、JH的合成和作用的调控网络
这些结果表明JH和20E分别是RG中参与蜕皮激素和JH生物合成相互调节的关键因子，从而提出了这两种激素在昆虫调控中串扰的模型（图5）。![]()
·4 主要结论
在果蝇幼虫发育中，JH与20E相互拮抗。本研究发现，JH通过诱导PG中Kr-h1表达抑制蜕皮激素合成，20E抑制CA中JH合成。二者在RG内相互调控对方合成，形成网络控制发育转变，且JH对胰岛素/ILP信号（IIS）调节存在复杂情况，此研究有助于理解昆虫变态发育机制。Reference：
Liu S, Li K,
Gao Y, et al. Antagonistic actions of juvenile hormone and 20-hydroxyecdysone
within the ring gland determine developmental transitions in Drosophila[J]. Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2018,
115(1): 139-144.
DOI：https://doi.org/10.1073/pnas.1716897115
本期分享来自2024级草学专业硕士研究生李忠意
