摘要：该研究探讨了碱性处理对植物生理特征的影响。研究发现，随着碱性处理时间的延长（从0天到7天），植物叶片中的脯氨酸浓度、丙二醛（MDA）水平和过氧化物酶（POD）活性发生显著变化。特别是在75 mM碱性处理下，这些指标显示出明显的统计学差异。此外，研究还观察到碱性处理7天后，植物的蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）、净光合速率（Pn）以及光系统II（Y(II)）量子产率显著下降。。这些发现有助于理解碱性胁迫对植物生理及抗氧化酶活性影响的机制。
关键词：lncRNA，甜菜，碱性胁迫
文 章 信 息
译名：甜菜 (Beta vulgaris L.) 碱性胁迫反应中的长非编码RNA
发表时间：2020年5月20日
期刊影响因子：4.3（2023）
第一单位：东北农业大学农学院
通讯单位：东北农业大学农学院
文 章 亮 点
1.文章详细探讨了碱性处理对甜菜叶片中脯氨酸浓度、丙二醛（MDA）水平和过氧化物酶（POD）活性的影响。研究发现，随着碱性处理时间的延长，这些生理指标发生了显著变化，特别是在75 mM碱性处理下，变化尤为明显。
2.该研究首次系统性地鉴定和表征了甜菜中响应碱性胁迫的lncRNA，揭示了它们在植物胁迫响应中的重要作用。这些发现为进一步研究和理解植物lncRNA的功能提供了数据支持。
文 章 简 介
1 研究意义
植物在面对非生物胁迫条件下的分子机制的复杂性和重要性，特别是碱性胁迫对甜菜（Beta vulgaris L.）的影响。甜菜作为一种重要的经济作物，其应对盐碱胁迫的机制已有一定研究，但对于长非编码RNA（lncRNA）在这一过程中所起的作用却鲜有深入探讨。lncRNA作为一种重要的基因调控因子，其在植物胁迫条件下的功能和机制逐渐受到关注，但具体到甜菜在碱性胁迫下的响应，系统性的研究仍然缺乏。该研究通过全基因组水平的检测和分析，鉴定并表征在碱性胁迫下甜菜的lncRNA，进而揭示这些lncRNA可能的调控作用及其与蛋白编码基因和miRNAs的相互作用。通过高通量测序技术和先进的生物信息学方法，研究不仅发现了大量与胁迫响应相关的lncRNA，还预测了它们的靶基因和可能的调控网络。研究结果不仅丰富了对甜菜在碱性胁迫下分子机制的理解，为抗逆性育种提供了新的分子工具和策略，也为进一步探索lncRNA在植物胁迫响应中的广泛功能奠定了基础。
2 研究方法
甜菜品种为KWS0143。将种子在含有蒸馏水的蛭石中萌发一周，随后，将幼苗在相对湿度65%、25℃/20℃（昼/夜）、光强450 μmol·m−2·s−1和16小时光照-8小时黑暗的光暗循环条件下，使用Hoagland溶液（pH 6.85）浇灌4周。最后，将幼苗用75 mM碱性溶液混合物（NaHCO3:Na2CO3，2:1，pH 9.67）分别处理不同时间：0天（对照，标记为C）、3天（短期处理，标记为ST）和7天（长期处理，标记为LT）。从不同处理的幼苗中采集相同位置的新鲜叶片，准备了3个生物重复。每个采集的叶片样本在采样后立即用液氮冷冻，并在-80℃下保存，用于生理参数测定、RNA测序和qRT-PCR分析。
3 研究结果
3.1 碱性胁迫对生理和生长特征的影响
为了研究不同时间长度的碱性处理对甜菜生理特性的影响，该研究测量了0天、3天和7天碱性处理植物叶片样品中的脯氨酸浓度、丙二醛（MDA）含量和过氧化物酶（POD）活性。如Fig. 1a-c所示，不同时间长度的碱性处理显著影响了这三种生理特性。上述生理特性的异质性表明甜菜在碱性处理后基因表达（包括lncRNAs）发生了明显的变化。同时测量了在水培条件下处理和未处理7天的植物的生长和光合特性。碱性处理后观察到了形态学变化（itional file Fig. S1a）。碱性处理显著抑制了植物生长。光合特性在碱性胁迫后发生了明显变化（附加文件图S1b-d）。例如，碱性处理植物的气孔导度（Tr）、气孔开度（Gs）和净光合速率（Pn）明显低于对照组（Additional file Fig. S1b-d）。而，对照组和碱性胁迫植物在光系统II（Y(II)）量子产量方面没有显著差异。光合和生长特性的显著变化表明碱性对植物生长的抑制作用。
3.2 碱性胁迫下lncRNAs的鉴定与表征
根据上述生理特性的变化，本研究从对照组、3天碱性处理和7天碱性处理的植物中收集了叶片样品进行高通量RNA测序。随后，在全基因组范围内系统地鉴定了lncRNAs，分别在对照组、短期和长期碱性胁迫植物库中鉴定出6085、6004和6611个lncRNAs（FPKM> 0.5）（Fig. 2b）。共鉴定出8535个具有可靠表达的lncRNAs，包括2051个反义lncRNAs和6034个正义lncRNAs。此外，对这8535个lncRNAs进行了基本基因组特性的表征。研究了lncRNAs在甜菜染色体中的分布，显示每兆碱基平均有15.06个lncRNAs（Fig. 2a）。lncRNA的转录长度范围为201–12,882（平均424）核苷酸，与甜菜蛋白编码基因（平均1998核苷酸）相比较短（Fig. 2c）。lncRNA的表达模式的平均计数（FPKM = 15.83）低于编码转录本的平均计数（FPKM = 19.11）（Fig. 2d）。根据保守性分析的结果，仅有少数甜菜lncRNAs在玉米、水稻和拟南芥中表现出保守性（Fig. 2e）。此外，根据对甜菜lncRNAs相对于ncRNAs NONCODE数据库的BLAST分析，检测到的98.6%的lncRNAs在甜菜中是特异的。此外，还研究了lncRNAs的序列，以确定它们作为已鉴定的miRNAs的靶标或前体的潜力。将miRNA前体与8535个lncRNAs进行比对，结果显示有三个lncRNAs可能是两个已鉴定miRNAs的前体（Table 1）。例如，估计lncRNA LNC_003048是gma-miR4995的前体。
3.3碱性胁迫lncrna的候选靶基因及其功能
lncRNAs在基因表达谱的调控中起着至关重要的作用，因此，鉴定和分析特定靶基因对于研究其相关功能可能是有帮助的。根据计算预测，共筛选出了133个碱性胁迫响应的lncRNAs候选靶基因（Additional file Table S2）。如之前的研究所示，lncRNAs更可能位于其调控基因附近。为了揭示这些已鉴定lncRNAs的可能影响，对碱性响应的lncRNA靶基因进行GO富集分析。在长期和短期碱性胁迫下，分别有6个和17个GO术语显著富集（P < 0.05）（Fig. 4）。主要的分子功能类别是激酶活性（GO:0016301）和核糖体结构成分（GO:0003735）。涉及核糖核蛋白复合物（GO:0030529）的基因在细胞成分中表现出高度代表性。关于生物过程，蛋白质代谢过程（GO:0019538）是最具代表性的GO术语，而细胞蛋白质代谢过程（GO:0044267）排名第二。蛋白质代谢过程在每个GO术语中显示出高度代表性，涉及482个基因。上述结果表明，碱性响应的lncRNAs可能调控参与多种生物过程的基因，例如能量合成、信号传导、解毒、分子代谢、翻译和转录，以应对盐和渗透胁迫。在胁迫条件下，许多GO术语显示出显著的富集，包括蛋白质代谢过程（GO:0019538）和核糖核蛋白复合物（GO:0030529），这些在短期和长期碱性胁迫下的叶片中显示出高度显著性（Fig. 4）。估计LOC104894575受lncRNA LNC_000365的调控，并与LOC104894575共表达。蛋白质代谢是植物中调节生长和发育以及应对环境胁迫的重要生物过程。我们的结果表明，LNC_000365可能通过调控LOC104894575的表达来调节蛋白质代谢。在非生物胁迫条件下，信号传导网络将被激活以应对这种压力环境。据建议，磷脂代谢途径在应对各种非生物挑战中起着重要作用。在本研究中，属于GO:0046488（磷脂酰肌醇代谢过程）的假设蛋白质同工型B基因LOC104888232在长期碱性胁迫下下调，并且lncRNA LNC_001194在LOC104888232编码序列上游37.9 kb处表达。根据研究结果，LNC_001194可能调节LOC104888232的表达。受到非生物胁迫的植物可能会表现出氧化损伤，这通过大量活性氧（ROS）的积累得以证明，从而损害膜系统。为了应对过量的ROS积累，植物会激活保护性酶以清除ROS。在本研究中，编码过氧化物酶（POD）的基因LOC104906740在短期碱性处理下的表达增加。本研究鉴定了与LOC104906740共表达的lncRNA LNC_007731。这些结果表明，LNC_007731可能通过调节POD表达参与植物的氧化应激耐受性调控。碱性对植物生长的抑制作用可归类为pH胁迫、渗透胁迫和离子毒性。植物经常表现出类似的耐受机制，包括磷脂信号传导的改变、能量合成和解毒，以应对盐或碱胁迫。在本研究中，离子转运蛋白基因LOC104906281和LOC104892091均在短期碱性胁迫下上调。我们鉴定了与LOC104892091共表达的lncRNA LNC_000365。这些结果表明，LNC_000365可能参与离子隔离。肽基脯氨酸修饰基因LOC104888024和甜菜碱醛脱氢酶基因LOC104894203分别在长期和短期碱性胁迫下上调。预测lncRNA LNC_004748与LOC104888024和LOC104894203共表达。这些结果表明，LNC_004748可能参与渗透调节。
3.4 碱性lncRNA表达与相关候选靶基因的关联
预测了响应碱性胁迫的这些lncRNA的候选靶基因后，确定了候选靶基因在碱性胁迫下的表达变化。在这133个候选共定位靶基因中，有4个在短期碱性胁迫下有显著变化，另有4个在长期碱性胁迫下在转录水平上表现出显著变化（P < 0.05）；对于候选共表达靶基因，在3492个候选基因中，分别有516个和210个在短期和长期碱性胁迫下在转录水平上显示出显著变化（P < 0.05）。上述候选靶基因在碱性胁迫下表现出显著的响应（P < 0.05）表达水平，可能作为碱性响应lncRNA的靶标。为了分析碱性响应lncRNA表达与候选靶基因表达的关联，比较了这些基因在碱性胁迫后的表达趋势。在短期碱性处理下，1550个（65.8%）和807个（34.2%）lncRNA-基因对分别表现出相同和相反的表达趋势（Fig. 5a）；而在长期碱性处理下，243个（65.9%）和126个（34.1%）lncRNA-基因对分别表现出相同和相反的表达趋势（Fig. 5b）。因此，大多数这些差异表达的靶基因在碱性胁迫后与相关lncRNA表现出相同的表达趋势。此外，筛选出4对lncRNA和靶基因，通过qRT-PCR检查其特定的表达水平。通过qRT-PCR识别的lncRNA表达与候选靶基因的关联与通过RNA-seq识别的结果相同（Fig. 5c）。例如，LNC_008363及其潜在靶基因（LOC104894889）在长期和短期碱性处理下均上调，表现出相同的表达趋势。此外，与特定候选靶基因相比，碱性响应lncRNA的表达关系揭示了多样的lncRNA调控机制。
4 讨论
目前，仅在几种植物中系统地鉴定了lncRNAs。本研究发现了8535个表达稳定的lncRNAs，并揭示了甜菜（Beta vulgaris L.）lncRNAs与其他物种中发现的lncRNAs具有相似的特征。首先，根据之前在斑马鱼、人类、水稻、黄瓜和拟南芥中的研究，与编码蛋白质的转录本相比，lncRNAs具有较短的长度和显著降低的表达水平。其次，不同于在各种植物物种中高度保守的miRNAs，植物中的lncRNAs表现出较低程度的进化约束。根据本研究的BLAST分析，相对于玉米、水稻和拟南芥基因组序列，只有少量甜菜lncRNAs是保守的（Fig. 2e）。此外，相对于NONCODE数据库对甜菜lncRNAs的BLAST分析，仅识别出我们的一小部分lncRNAs（1.4%）是保守的。其他植物物种的lncRNAs也显示出类似的观察结果，包括玉米、水稻、拟南芥、黄瓜、小麦和杨树。鉴于如此低的保守水平，植物中的此类lncRNAs可能经历快速进化。第三，类似于水稻、拟南芥、人类和其他物种中的lncRNAs，在甜菜中也有一些lncRNAs被鉴定为miRNA前体或靶标模拟物（Table 1）。上述发现表明，miRNAs与lncRNAs的关联可能在lncRNAs中起重要作用。因此，本研究提供了丰富的证据来研究甜菜lncRNAs的功能。先前的研究表明，lncRNAs在各种生物过程中发挥重要作用。然而，对碱性响应lncRNA功能的理解尚不完全。据报道，lncRNAs通过与miRNAs和靶基因的相互作用来发挥其功能。因此，预测和分析与lncRNAs相互作用的miRNAs和靶基因是研究特定lncRNA功能的有效方法。本研究预测了碱性响应lncRNAs的候选靶基因。此外，我们鉴定了七个lncRNAs作为17个已知miRNAs的前体（Table 1），以及四个碱性响应lncRNAs作为来自四个家族的八个miRNAs的靶标（Table 2）。
5 主要结论
通过高通量测序技术，从三个甜菜（Beta vulgaris L.）RNA-seq文库中共发现了8537个可靠的lncRNAs。其中，102个和49个分别对短期和长期碱性胁迫做出了响应。在这些碱性响应的lncRNAs中，有六个在短期和长期碱性胁迫下都上调，而五个在两种胁迫下都下调。在对碱性胁迫有反应的这些lncRNAs中，有四个被鉴定为四个家族中八个miRNAs的靶标。在比对miRNA前体与8535个lncRNAs后，发现了七个lncRNAs作为17个已知miRNAs的前体。此外，计算预测结果显示，响应碱性胁迫的lncRNAs有4318个候选靶基因。我们发现细胞结构、分子功能和生物过程中的GO术语富集，包括激酶活性、核糖体结构成分、核糖核蛋白复合物和蛋白质代谢过程。基于基因组共定位和共同表达的蛋白编码基因和lncRNAs建立了一个互作网络。根据我们的发现，lncRNAs可能通过与蛋白编码基因的相互作用，在调节植物对碱性处理的响应和适应过程中发挥重要作用。上述结果为进一步研究植物lncRNAs的功能特性，特别是在非生物胁迫下的甜菜lncRNAs，提供了线索。
Reference:
Zou, C., Wang, Y., Wang, B., Liu, D., Liu, L., Gai, Z., & Li, C. (2020). Long non-coding RNAs in the alkaline stress response in sugar beet (Beta vulgaris L.). BMC plant biology, 20, 1-14.
https://doi.org/10.1186/s12870-020-02437-w
本期分享来自2023级农艺与种业专业硕士研究生何小聪
