摘要：该研究首先分析了不同蚜虫种类的18个唾液蛋白质组，这些唾液蛋白质可主要分为7个功能群。其次，创建了一个融合dsRNA设计方法，可靶向害虫多个基因，但对有益昆虫是选择性安全的。基于这种方法，设计了7个融合dsRNA饲喂桃蚜，导致蚜虫适应性显著降低。摄食过氧化物酶dsRNA的桃蚜引发寄主植物H2O2含量最高，对天敌(龟纹瓢虫和寄生蜂)有吸引力，但对其他蚜虫具驱避作用。这些结果表明，融合dsRNA可以提高蚜虫的控制能力，并且针对唾液蛋白编码基因的融合dsRNA可以增强寄主植物的直接和间接防御能力，为基于RNAi的蚜虫控制提供了一种新的策略。
关键词：蚜虫；唾液蛋白；RNAi
文 章 信 息
译名：针对唾液蛋白基因的融合dsRNA增强了基于RNAi的蚜虫防治
发表时间：2023年12月
期刊影响因子：4.2（2023）
第一单位：西南大学植物保护学院昆虫学及害虫控制工程重点实验室
通讯单位：西南大学植物保护学院昆虫学及害虫防治工程重点实验室
文 章 亮 点
1.分析了不同蚜虫种类的18个唾液蛋白质组，且将其主要分为7个功能群。
2.创建融合dsRNA设计方法，以此设计了7个唾液蛋白编码基因功能群融合dsRNA对蚜虫进行RNAi。
3.针对唾液蛋白编码基因的融合dsRNA可以增强寄主植物的直接和间接防御能力。
1 研究意义
蚜虫取食植物时会分泌凝胶唾液和液体唾液。蚜虫唾液蛋白对蚜虫在植物上的定殖至关重要，抑制蚜虫唾液蛋白编码基因的表达可直接导致蚜虫死亡、适合度降低以及间接引发更高的植物防御，这些基因是非靶标生物的安全RNAi靶标。该研究希望通过多个基因共沉默增强基于RNAi的蚜虫控制，设计了一种融合dsRNA，以多种具有相似功能的唾液蛋白编码基因为目标，为基于RNAi的蚜虫控制策略提供一种新的方法。
2 研究方法
3 研究结果
3.1不同蚜虫种类唾液蛋白基因潜在RNAi靶点的探索
共获得149个豌豆蚜唾液蛋白。在该文库中，有103个蛋白被注释，其中59个蛋白被SignalP预测呈现分泌信号。为了鉴定不同蚜虫物种中保守的唾液蛋白，根据注释对蛋白质进行了分类（Fig. 1）。包括氧化还原酶、过氧化物酶、过氧化物氧化还原酶、水解酶、细胞骨架蛋白、DNA结合蛋白和锌结合蛋白、伴侣蛋白、脱辅基蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶和RNA导向的DNA聚合酶等。
3.2靶向蚜虫多个基因但对瓢虫安全的融合dsRNA设计
为解决蚜虫唾液蛋白基因多，dsRNA靶向单个基因可能并不有效这一问题，创建了一种融合dsRNA设计方法。将不同基因的片段连接在一个dsRNA中，这些片段高度保守，可以在各种蚜虫中产生有效的siRNA，同时也可以避免对益虫（如对RNAi敏感的龟纹瓢虫）的脱靶风险。如针对Ca2+结合蛋白的融合dsRNA设计（Fig. 2）。
3.3.摄入融合dsRNA降低了蚜虫的适应成本
7种融合dsRNAs均显著诱导了桃蚜死亡率增高、繁殖力降低（Fig. 3）。过氧化物酶、水解酶和Ca2+结合蛋白的融合dsRNAs导致最高的死亡率（62%、55%和53%）和最低的繁殖力。此外，与dsGFP对照相比，融合dsRNA处理的蚜虫体重、体长和体宽均显著减少，其中过氧化物酶、水解酶和Ca2+结合蛋白融合dsRNAs处理组减少最多。
3.4融合dsRNA诱导直接和间接控制蚜虫的能力
融合过氧化物酶基因dsRNA诱导的死亡率明显高于单独沉默1种过氧化物酶基因（Fig. 4A、B）。融合过氧化物酶dsRNA处理后，烟叶中H2O2含量显著高于各过氧化物酶dsRNA处理（Fig. 4C）。用融合过氧化物酶dsRNA处理蚜虫后，桃蚜对烟草幼苗表现出排斥反应，其中只有35%的桃蚜成虫选择了处理后的烟草幼苗（Fig. 4D）。处理后的烟草幼苗吸引了瓢虫和寄生蜂，其中70%的龟纹瓢虫成虫和76%的烟蚜茧蜂成虫选择过氧化物酶处理后的烟草幼苗。
3.5.瓢虫的安全性评价
潜在性脱靶基因在龟纹瓢虫中的表达未发生改变，4龄幼虫死亡率和蛹重在对照组（H2O、dsGFP）和处理组（dsperoxidase）差异不显著（Fig. 5）。
4 讨论
该研究构建了一个包含最丰富的豌豆蚜虫唾液蛋白（149个蛋白）的新文库。这些唾液蛋白可以被分类到蚜虫与植物相互作用的不同阶段：（1）唾液鞘形成（细胞骨架蛋白有利于唾液鞘的结构完整性）。（2）打破植物物理屏障。（3）响应植物早期防御（Ca2+结合蛋白与钙离子结合防止筛管堵塞，过氧化物酶可以降低植物H2O2水平）。（4）响应植物晚期防御（氧化还原酶分解植物有毒次生代谢产物）。（5）促进肠外消化（唾液蛋白有助于韧皮部物质的肠外消化）。蚜虫唾液中还存在大量未知蛋白质需要进一步研究，以增强对蚜虫-植物相互作用的理解。
研究采用融合dsRNA设计，靶向多个唾液蛋白基因。结果表明，所有功能性dsRNA都能引起蚜虫死亡率上升和繁殖力、体型的减少。融合dsRNA设计提供了一种新的dsRNA设计策略，该策略可以包括对有害生物的多个保守目标，并减少对有益生物的脱靶。通过融合dsRNA沉默同源血红素过氧化物酶的目的是抑制蚜虫唾液介导的活性氧（如H2O2）的还原，从而增强植物防御、诱导蚜虫死亡。融合过氧化物酶dsRNA相比单个过氧化物酶dsRNA能诱导较高的蚜虫死亡率和植物H2O2。这些结果表明，融合dsRNA设计策略可以提高蚜虫控制能力。
相较于对照，龟纹瓢虫和烟蚜茧蜂更倾向于选择经dsperoxidase处理过的蚜虫取食的烟草幼苗。烟草植株在被dsperoxidase处理过的桃蚜取食后，会释放出挥发性物质吸引天敌，这可能是桃蚜抑制烟草植株激素防御能力下降所致。基于靶向唾液蛋白基因的RNAi策略提高了寄主植物抗性和生物防治的有效性。这些物质是植物的自然挥发物，不会造成对动物和环境的毒性问题，是一种可持续的害虫管理方法。将RNAi与生物防治协同作用的害虫治理方法称为基于RNAi的生物防治。除了天敌，RNAi还可以与其他生物防治因子协同作用，包括Bt毒素、昆虫病原微生物和肠道微生物。与传统杀虫剂相比，这种方法可以特异性抑制害虫种群，在生态系统中没有非靶标效应。因此，基于RNAi的生物防治是较有前景的防治策略。
5 主要结论
该研究创建了一种融合dsRNA设计方法，其可靶向多个唾液蛋白基因。7种功能性融合dsRNA显著诱导了蚜虫的死亡率、减少了繁殖力和体型。此外，融合过氧化物酶dsRNA还诱导了间接灭蚜能力，提高了基于RNAi的生物防治灭蚜能力。该方法为蚜虫防治提供了一种新的策略，并将改进基于RNAi的害虫防治策略。
Reference：
Yang L, Qin C Y, Chen Y, et al. Fusion dsRNA in targeting salivary protein genes enhance the RNAi-based aphid control[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2023, 197: 105645.
https://doi.org/10.1016/j.pestbp.2023.105645
本期分享来自2024级草学专业硕士研究生李忠意
