摘要：本研究鉴定和分析了花生中495个LRR-RLK基因，并将其与拟南芥同源物进行系统进化树分析，划分为14个类群和10个亚类群。其中，491个基因不均匀分布于20条染色体上。基因结构和蛋白质基序的分析显示，同一亚群内成员的外显子/内含子和基序组织相似。同时，发现了基因重复事件，对LRR-RLK基因家族的扩增具有重要意义。通过RNA-seq数据，我们检测到AhLRR-RLK基因在不同组织中的表达差异，表明其可能具有不同功能。此外，过表达AhLRR-RLK265增强了拟南芥对盐和干旱胁迫的耐受性，相关抗氧化酶活性显著提高。这些结果为进一步分析AhLRR-RLK基因的功能提供了重要信息。
文 章 信 息
译名：花生LRR-RLK基因家族的全基因组鉴定及AhLRR-RLK265在盐和干旱胁迫下的功能表征
发表时间：2023年11月04日
期刊IF：7.7（2023）
第一单位：山东省花生研究所
通讯单位：山东省花生研究所
文 章 亮 点
1.栽培花生(Arachhis hypogaea L.)是世界上重要的经济作物和油料作物，为人类的营养提供油脂和蛋白质。世界花生的年产量约为5000万吨，在生长阶段受到极端温度、高盐度和干旱等几种环境压力的影响。已有报道称，LRR-RLKs在植物中起着至关重要的作用。
2. 富含亮氨酸的重复受体样激酶(LRR-RLKs)在植物发育调控和各种逆境响应中发挥着重要作用。花生(Arachhis hypogaea L.)是世界上重要的油料作物，然而，目前还没有对花生LRR-RLK基因家族进行系统鉴定和分析的报道。
文 章 简 介
1 研究意义
目前，我们对LRR-RLK基因家族的了解非常有限。盐胁迫和干旱胁迫是影响作物发育和产量的两种常见的非生物胁迫(渗透胁迫)。当植物遭受盐和干旱的压力时，细胞会失去大量的水分。渗透调节可以增强水分吸收，同时应对盐和干旱胁迫。本研究从花生数据库中鉴定出495个AhLRR-RLK基因。对鉴定的AhLRR-RLKs进行系统发育关系、基因结构、顺式作用元件、染色体定位、重复事件和表达模式的综合分析。此外，AhLRR-RLK265在拟南芥中的过表达增强了耐盐性和耐旱性，揭示了LRR-RLK基因家族可能在花生发育和盐胁迫、干旱胁迫的响应中起重要作用，为进一步提升花生在干旱和盐碱环境下的耐受性提供了新的思路。
2 研究方法
2.1植物材料
本研究选择耐盐栽培花生“花育67”(HY67)进行处理。将生长状况相似的HY67幼苗分别用200 mM NaCl和20%聚乙二醇(PEG) 6000处理0、6、24和48 h。在ABA处理方面，分别用50 μM ABA处理幼苗0、1、3和6 h。每个样品使用3个生物重复。
2.2试验方法
主要涉及的试验方法：AhLRR-RLK基因家族的鉴定与分析、构建载体与拟南芥植物转化、过表达AhLRR-RLK265的拟南芥株系对ABA的敏感性分析等。
3研究结果
3.1 AhLRR-RLKs的鉴定与表征
利用BLASTP和HMM从花生基因组中鉴定LRR-RLK基因，共识别出495个AhLRR-RLK、206个AdLRR-RLK和198个AiLRR-RLK基因。495个AhLRR-RLK基因中，491个分布在20条染色体上，命名为AhLRR-RLK001至AhLRR-RLK491，其余4个基因分别定位于scaffold44、scaffold45和scaffold55，命名为AhLRR-RLK492至AhLRR-RLK495。
蛋白特性分析显示，AhLRR-RLK的氨基酸长度范围为388个（AhLRR-RLK209）至1526个（AhLRR-RLK294），分子量为43.06 kDa（AhLRR-RLK209）至172.95 kDa（AhLRR-RLK294），理论等电点（pI）为5.2（AhLRR-RLK425）至9.43（AhLRR-RLK300）。AdLRR-RLK和AiLRR-RLK的氨基酸长度和分子量也有类似分布。这些结果为进一步研究LRR-RLK在花生中的功能提供了基础数据。
3.2多序列比对及系统发育分析
花生和拟南芥中的LRR-RLK氨基酸长度序列（图1和S1）。经过系统发育分析，结果显示，花生LRR-RLK蛋白与225个拟南芥LRR-RLK蛋白被划分为14个类群。其中，五个组（VII、VIII、X、XII和XIII）被进一步细分为两个亚组。大多数亚组同时包含花生和拟南芥成员，表明两者的分化时间晚于LRR-RLK基因家族的形成。III、XI和XII-a、XII-b组的成员数量最多，分别为89、79、58和49个，而I、VII-b、X-b和XIII-b组的成员数量较少，分别为4、1、4和4个。这些发现揭示了花生和拟南芥LRR-RLK基因家族的进化关系。
3.3基因结构，保守和功能基序
花生LRR-RLK基因的外显子数量从3个到28个（图2）。其中，同一组内的LRR-RLK基因显示出相似的结构，与系统发育分析的结果一致。共鉴定出15种不同基序，其中基序7、8和15代表了富含亮氨酸的重复序列（LRR）结构域，所有LRR-RLK成员均含有这些基序。此外，报道表明，植物肽的最后一个氨基酸与LRR结构域的RxR基序形成盐桥。拟南芥中的多个LRR-RLK成员（如RLK7、IKU2等）包含这一保守的RxR基序，表明它们可能是小肽的受体。在花生XI组的LRR-RLK成员也发现具有这一保守基序，说明它们可能通过RxR基序识别特定的肽配体。
3.4染色体定位和重复分析
染色体定位结果显示，495个花生LRR-RLK基因中，491个被定位到20条染色体上，数量最多的是Chr14（40个基因），Chr03含有38个基因，Chr04和Chr13各有37个，而Chr18仅有12个基因。大部分花生LRR-RLK基因位于染色体末端，且有42个基因在多个染色体（如Chr02、Chr03等）上分布。此外，scaffold44上的两个基因（AhLRR-RLK492/493）也表现类似重复的现象。
通过分析，发现299个花生LRR-RLK基因中有170个涉及片段重复，这表明基因复制可能推动了其进化。计算了LRR-RLK基因对的Ka/Ks比值，结果显示大部分基因（170对片段和22对串联重复）的Ka/Ks < 1，表明它们经历了纯化选择压力。然而，有一对邻近重复基因（AhLRR-RLK284/285）的Ka/Ks > 1，说明这两个基因可能经历了正向选择压力。
3.5 AhLRR-RLK基因的合成分析
为推断花生LRR-RLK基因的系统发育关系，我们构建了花生与其他四个代表性物种（拟南芥、大豆、番茄和水稻）的合成图谱（图3）。发现319个花生LRR-RLK基因显示出与这些物种的合成关系，其中番茄、拟南芥和水稻分别为189、149和42个同源基因对。大豆、番茄、拟南芥和水稻的预测同源基因对数为740、253、198和57。
此外，我们还发现一些花生LRR-RLK基因（如AhLRR-RLK147和AhLRR-RLK288）存在于至少4对共线基因中，尤其是花生与大豆之间，这表明它们在花生进化中的重要性。此外，花生与其他四种植物之间共有23对共线基因，表明这些基因在植物分化之前就已存在。有趣的是，91个花生LRR-RLK基因的共线对在花生与拟南芥、大豆和番茄之间被识别出，而在花生与水稻之间则未发现，可能表明这些共线对在双子叶和单子叶植物分化后形成（表S4）。
3.6 AhLRR-RLK基因在不同组织中的表达
为了解花生LRR-RLK基因的潜在功能，我们分析了其在18个组织（如叶、茎、根、根瘤、果实、种子等）中的RNA-Seq表达模式（图S8）。结果显示，495个基因中有108个（21.8%）在多个组织中均表现出较高的表达水平，包括AhLRR-RLK068、AhLRR-RLK147等。此外，部分花生LRR-RLK基因显示出组织特异性表达。例如，AhLRR-RLK130、AhLRR-RLK179和AhLRR-RLK302仅在雌蕊中表达，而AhLRR-RLK009和AhLRR-RLK253则专门在根和根瘤中表达。AhLRR-RLK343、AhLRR-RLK399和AhLRR-RLK407在叶片中的表达量高于其他组织。这些结果为花生LRR-RLK基因在不同组织中的功能提供了线索。
3.7 AhLRR-RLK基因在逆境处理下的表达模式
为研究花生LRR-RLK基因在盐和干旱胁迫下的表达变化，我们随机选择了15个不同支系的基因，采用qRT-PCR进行分析。结果显示，部分花生LRR-RLK基因在盐和干旱处理后表达显著上调。例如，11个基因在盐处理后表达量上调超过2倍，5个基因在干旱处理后也有类似表现（图4）。在盐胁迫下，AhLRR-RLK131、AhLRR-RLK332和AhLRR-RLK382的表达趋势是先上升再下降，在6 h下达到峰值；AhLRR-RLK155、AhLRR-RLK241、AhLRR-RLK426和AhLRR-RLK490在24 h后表达升高后开始下降；而AhLRR-RLK021和AhLRR-RLK085在48小时后达到峰值（图4A）。在干旱胁迫下，AhLRR-RLK192、241、265和490在48 h内表达高峰，AhLRR-RLK426在6 h达到峰值（图4B）。特别值得注意的是，盐和干旱胁迫对AhLRR-RLK265的诱导作用显著（>45倍和>700倍），而AhLRR-RLK215则在整个处理过程中受到负调控。这些结果进一步表明，LRR-RLK基因参与了花生对非生物胁迫，尤其是盐胁迫的反应。
3.8 AhLRR-RLK蛋白的亚细胞定位
利用SMART在线工具预测，AhLRR-RLK265蛋白含有一个信号肽、十个LRR基序、一个跨膜区和一个激酶区（图5A）。为分析花生LRR-RLK蛋白的亚细胞定位，选择AhLRR-RLK265进行实验。通过共聚焦显微镜观察35S::AhLRR-RLK265-GFP融合构建体和35S::GFP（空载体）在拟南芥中的瞬时表达，结果显示空载体的绿色荧光分布在质膜和细胞质上，而AhLRR-RLK265-GFP融合蛋白仅在质膜上定位，说明AhLRR-RLK265可能定位于质膜（图5B）。
3.9过表达AhLRR-RLK265增强了耐盐性和耐旱性
为了进一步探究AhLRR-RLK265在非生物胁迫中的作用，我们构建了过表达AhLRR-RLK265的转基因拟南芥植株，并通过PCR和qRT-PCR验证了15个T0转基因品系中纯合子T3代的表达水平。高表达的OE3和OE5系在150 mM NaCl处理下的种子发芽率明显高于野生型拟南芥（图6A和D），同时在1/2 MS含150 mM NaCl的培养基上生长的转基因幼苗的初生根显著长于野生型（图6B和E）。
在300 mM NaCl胁迫处理1周后，野生型植株出现明显的萎蔫现象，而转基因植株的萎蔫程度较轻。在盐处理后，转基因及野生型植株的活性氧清除酶SOD、POD和CAT活性均显著提高，但转基因植株的酶活性明显高于野生型。此外，盐处理后转基因植株的MDA含量降低（图7），表明过表达AhLRR-RLK265增强了拟南芥的耐盐性。
在耐旱性分析中，OE3和OE5系在300 mM甘露醇处理下的种子发芽率也高于野生型。在含300 mM甘露醇的1/2 MS培养基上生长的转基因幼苗的初生根也明显长于野生型（图8）。将7日龄的野生型与过表达系幼苗转移至混合土中正常生长3周，并未观察到生长差异。然而，在干旱处理2周后，野生型植株的叶片大多出现萎蔫现象，而转基因植株的萎蔫程度较轻。干旱处理后，野生型与转基因植株的活性氧清除酶活性均升高，但转基因植株的酶活性依然高于野生型，且转基因植株的MDA含量进一步降低（图9）。这些结果表明，过表达AhLRR-RLK265显著增强了拟南芥的抗盐和抗旱性。
3.10 AhLRR-RLK265在拟南芥中的过表达导致ABA过敏
在花生幼苗中，AhLRR-RLK265在ABA处理后6 h表达上调，并在3 h达到峰值（图10C）。为探究AhLRR-RLK265是否参与ABA响应，本研究开展了萌发和根伸长试验，分析AhLRR-RLK265-OE系对ABA处理的敏感性。结果显示，AhLRR-RLK265-OE系的发芽率和根长与未添加外源ABA的野生型相近。然而，在含1 μM ABA的1/2 MS培养基上生长时，AhLRR-RLK265-OE株系和野生型的发芽率和根长均显著降低，且AhLRR-RLK265-OE株系的发芽率和根长显著低于野生型（图10），表明AhLRR-RLK265-OE植株对外源ABA表现出更高的敏感性。
此外，在盐和干旱条件下，ABA信号基因AtABI3和AtABI5的表达在过表达系中显著高于野生型植物（图S9），进一步支持了AhLRR-RLK265在ABA信号通路中的功能。这些结果表明，AhLRR-RLK265可能在ABA响应过程中发挥关键作用。
4 讨论
LRR-RLK是细胞表面的主要受体之一，在多种发育过程和对环境胁迫的响应中发挥重要作用。研究显示，拟南芥、番茄和大豆分别鉴定出了225个、234个和467个LRR-RLK成员，但花生的相关信息仍有限。本研究通过生物信息学手段分析了花生LRR-RLK基因，包括AhLRR-RLK的系统发育、基因结构、基序排列等。从花生基因组中鉴定出495个AhLRR-RLK成员，与拟南芥的LRR-RLK成员分成14个组和10个亚组，表明花生的AhLRR-RLK基因数量高于模式植物拟南芥，类似于古多倍体的大豆和六倍体的面包小麦。
基因结构在LRR-RLK家族的进化中起重要作用，AhLRR-RLK基因在同一群或亚群内高度保守。此外，基因的片段重复和串联重复对其扩展起着关键作用，研究发现花生LRR-RLK基因家族中，存在170个片段重复对和23个串联重复对，说明基因的扩增主要由片段重复造成。
在植物的非生物胁迫响应中，LRR-RLK蛋白发挥重要作用。AhLRR-RLK155与盐胁迫相关，且AhLRR-RLK021和AhLRR-RLK265表现出对外源ABA的敏感性。研究结果表明，过表达AhLRR-RLK265可以增强拟南芥的耐盐性和耐旱性。在盐和干旱胁迫下，过表达品系的抗氧化酶活性显著高于野生型，表明其氧化损伤更小。
通过与多肽的结合，LRR-RLK可能在植物应对逆境中发挥调节作用。AhLRR-RLK192和AhLRR-RLK426在盐和干旱胁迫下表现出高表达，系统揭示了它们可能参与了对植物非生物胁迫的响应，尽管其具体功能仍需进一步研究。
5 结论
AhLRR-RLK基因可能在调节花生对非生物胁迫的反应和发育中起重要作用。然而，在未来的研究中，单个AhLRR-RLK基因在花生发育和应激反应中的具体作用需要使用现代基因组编辑和功能基因组学工具来验证。综上所述，本研究结果有助于我们进一步研究AhLRR-RLK基因的具体功能，为花生抗逆性育种提供一些新的基因资源。
Reference：
Qi Wang, Xiaobo Zhao, Quanxi Sun, Yifei Mou, Juan Wang, Caixia Yan, Cuiling Yuan, Chunjuan Li, Shihua Shan. Genome-wide identification of the LRR-RLK gene family in peanut and functional characterization of AhLRR-RLK265 in salt and drought stresses. International Journal of Biological Macromolecules, 2024, 254, 127829.
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.127829
本期分享来自2024级草学专业硕士研究生刘月
