事实上，几个世纪以来，全球范围内新的（此前未被发现的）和旧的感染性流行病不断出现，给全世界公共卫生和经济稳定造成了沉重负担。
医学上，凡是由病原体（微生物）引起的疾病统称为感染性疾病（infectious diseases，ID）。感染性疾病也是导致人类死亡和残疾的主要原因之一。
微生物即微小的生物，体积非常小，借助显微镜才能看到；病原体是指可引起疾病的微生物。
病原体有许多不同种类，包括：细菌、真菌、病毒、寄生虫四类。
图1：病原体分类
常见呼吸道病原体包括流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、腺病毒、巨细胞病毒等。
图2：常见呼吸道病原体
呼吸道病原感染之所以频繁上热搜，与以下几个因素密切相关：
首先，随着新冠疫情的逐渐缓解，人们的生活逐步恢复正常，社交活动增多，导致病毒传播途径更加广泛。其次，气温波动较大，季节交替之际，人体免疫力相对较低，容易受到病毒侵袭。此外，病毒变异速度加快，使得原有疫苗和药物的治疗效果降低，防控难度加大。
诊断技术的进步在感染性疾病（包括呼吸道感染）的控制中发挥了关键作用，目前临床常用的病原体检测方法主要有5种：涂片镜检、分离培养、抗原检测、血清抗体检测、核酸检测。相比之下，传统微生物学及免疫学技术灵敏度偏低，核酸检测技术有其敏感性高、特异性强的优势，被视为金标准方法。
指标 | 优势 | 局限性 |
核酸 | 1、检测方法学为金标准 2、潜伏期即可测得，灵敏度、特异性高，不受抗菌药物用药影响 3、早期诊断，为疾病治疗争取时间 | 1、难以区分定植微生物和病原微生物，无法做体外药敏实验结果 |
抗原 | 1、简便、快捷 2、早期诊断，为疾病治疗争取时间 3、抗原检测结果不受机体免疫状况影响 | 1、灵敏度、特异性较核酸检测有较大差距 2、阴性不能排除感染 |
抗体 | 1、抗体的检测结果提示感染的发生 2、具有回顾性诊断的临床意义 | 1、对于疾病早期诊断帮助不大 |
涂片镜检 | 1、快速 2、观察有无白细胞吞噬病原微生物的现象，可依据疑诊病原体采取特殊染色进行诊断 | 1、灵敏度、特异性低，受操作者经验限制 |
细菌培养 | 1、标本容易收集，可结合体外药敏实验结果为治疗提供有用的信息 | 1、灵敏度和特异性低 2、某些病原体耗时长或培养困难 3、受抗菌药物用药影响，可能导致假阴性结果 |
目前关于呼吸道感染病原体核酸检测出了两份共识（《儿童呼吸道感染病原体核酸检测专家共识（2022）》和《成人呼吸道感染病原诊断核酸检测技术临床应用专家共识(2023)》），共识对呼吸道病原体核酸检测技术的特点和适用范围做了归纳和总结，及其应用策略也给出了明确推荐意见，指导临床实践。
既然核酸检测方法好，那咱们就先根据以上两份共识一起掰掰目前有哪些好的技术。
一、病原体基因组序列依赖性核酸检测方法
采用靶向病原体基因组的引物，通过链特异性延伸、杂交、编辑等方式实现靶向目标序列的扩增，获得可被检测到的信号，这是病原体检测常用的技术方法。常用的方法包括以下几类：实时荧光PCR（qPCR）、等温扩增技术、数字PCR技术、POCT技术、tNGS技术，下面对以下技术进行简要介绍。
1、实时荧光PCR（Quantitative Real-time PCR ，qPCR）
实时荧光PCR技术是在PCR体系中加入含有荧光基团的底物，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，实现对起始模板定量及定性的分析方法。具有高灵敏、高特异性，广泛用于基因表达分析、病原体检测、基因突变分析等领域。包括两种主要方法：染料法和探针法。
图3：实时荧光PCR染料法原理图
图4：实时荧光PCR探针法原理图
01技术优点：
1）检测敏感性高，特异性高，尤其是探针法；
2）方法成熟稳定，配套的仪器和试剂种类繁多，能够满足不同实验需求。
02技术局限性：
1）目的基因发生突变导致漏检；
2）低浓度模板检测结果无法确定；
3）使用标准曲线进行定量检测时误差较大。
03应用场景：
1）门急诊检查，大规模人群筛查；
2）流行病学调查，医院获得性重症肺炎/社区获得性肺炎/混合感染诊断（多重荧光PCR）。
2、等温扩增技术
等温扩增技术是一种在恒定温度下进行核酸扩增的分子生物学方法，与传统的PCR技术相比，不需要热循环仪器，具有操作简便、反应速度快、灵敏度高、特异性强等优点，适用于多种领域，如疾病诊断、食品安全、环境监测等。
图5：等温扩增技术简介
图6：等温扩增技术与其他PCR技术的对比
01技术优点：
1）不需要PCR仪，操作简单；
2）反应耗时短，扩增快速高效。
02技术局限性：
1）引物设计复杂；
2）特异性相对较差，容易引起假阳性。
03应用场景：
1）发热门诊，急诊，即时检测。
3、数字PCR技术（Digital PCR, dPCR）
数字PCR技术（Digital PCR, dPCR）是一种核酸分子绝对定量技术，其核心原理在于将PCR反应体系分割成数万个独立的微小反应单元，每个单元包含一个或多个目标DNA分子，通过PCR扩增后统计每个单元的荧光信号来实现绝对定量。
图7：数字PCR技术的实验流程图
01技术优点：
1）样本需求量低；
2）高灵敏度，能够检测到极低浓度的目标分子；
3）无需标准曲线和标准品，有效减少本底对扩增的干扰，具有良好的重现性和准确度；
4）绝对定量，可以直接计算出目标分子的绝对拷贝数。
02技术局限性：
1）不同厂家试剂和平台的检测结果存在差异，尚无可评估质控方法；
2）通量受限，依托荧光探针进行定量检测的方法受限于靶标；
3）动态检测范围较窄，不适用于检测浓度相对较高的样本；
4）设备价格和使用成本偏高。
03应用场景：
1）定量检测，疗效评估，环境检测，参考品或标准品定标。
4、核酸即时检测（POCT）技术
核酸POCT为POCT技术中涉及核酸检测的一大类技术的总称，是核酸提取技术和分子扩增技术（包括实时荧光PCR、巢式PCR、等温扩增、数字PCR等技术)的融合。其最大特点是将核酸的提取、扩增、检测均置于一个反应装置中，通过特定设备对扩增信号检测，完成对靶标核酸的筛查。
图8：POCT常用检测方法
图9：核酸POCT常用技术
01技术优点：
1）便捷，对场地要求低；
2）便于操作，能快速获取结果；
3）自动化，对人员操作能力要求低。
02技术局限性：
1）检测通量较低，不适用于大规模人群筛查；
2）单次检测成本高；
3）适用范围有限。
03应用场景：
1）发热门诊，急诊，床旁检测。
5、tNGS技术
tNGS即靶向下一代测序技术，是一种针对特定基因序列进行高通量测序的技术，主要用于感染性疾病的诊断和治疗，特别是呼吸道感染和结核病等。
图10：tNGS检测流程图
01技术优点：
1）高灵敏度和高特异性；
2）低成本、快速检测；
3）不易受人类基因组及背景菌影响；
4）能够同时检测耐药基因和毒力基因。
02技术局限性：
1）仅能检测靶标范围内的病原体；
2）无法鉴别污染、定植还是活动性感染；
3）缺乏统一的质控标准。
03应用场景：
1）门急诊，发热门诊，普通病房，ICU，反复呼吸系统感染查因。
二、病原体基因组序列非依赖性核酸检测方法
1、mNGS技术
mNGS是非序列依赖的新型核酸检测方法,是新发突发传染病和临床未知病原体鉴定的重要技术方法。mNGS是用高通量测序平台对感染部位样本中提取的核酸进行高通量测序，通过将测序数据与数据库序列的比对分析，获得样本中包含的病毒、细菌、真菌和寄生虫等的病原微生物种类。
图11：mNGS检测流程图
01技术优点：
1）广泛的病原体检测谱；
2）发现未知病原体；
3）检测耐药基因；
4）高敏感性和广覆盖。
02技术局限性：
1）可能漏检低浓度致病微生物；
2）难以实现特定的耐药或毒力基因分析；
3）检测结果的解释需结合临床情况。
03应用场景：
1）传统病原学检测无法诊断的疑难重症病例。
在熟悉不同技术后，就需要我们根据临床实际应用情况选择不同的技术。在确定好技术平台后，我们需要选择合适的仪器和试剂，对选择的仪器和试剂进行方法学验证或者确认，确认合格后才能应用于临床实践。各种方法的具体验证或确认要求参考如下：
今天就先和大家一起学习到这，后期会对呼吸道病原检测最近批证较多的POCT仪器和呼吸道多重病原体检测商业化试剂进行汇总学习，期待您的陪伴，谢谢！
参考资料：
[1]儿童呼吸道感染病原体核酸检测专家共识（2022）.
[2]成人呼吸道感染病原诊断核酸检测技术临床应用专家共识(2023).
[3]涨知识啦！一览常见呼吸道病原体核酸检测技术.
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