大家好，本周分享一篇2022年7月发表在Analytical Chemistry（IF=8.008）的文章，题目是“Single-Cell Mass Spectrometry Enables Insight into Heterogeneity in Infectious Disease ”。该研究的通讯作者是来自俄克拉荷马大学的Zhibo Yang（杨志柏）教授，主要研究方向是现代质谱技术的发展和应用，包括单细胞检测和组织成像等。
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首次证实了克氏锥虫对感染细胞邻近的未感染细胞的旁观者效应。
恰加斯病（CD）是由克氏锥虫感染的热带疾病，会导致宿主的心脏和胃肠道受到严重的干扰。克氏锥虫感染导致宿主细胞内脂质和葡萄糖代谢的紊乱。克氏锥虫感染期间，实验感染动物心脏中的代谢变化与紊乱程度成正比，体内代谢变化的不同空间分布反映了恰加斯病倾向的部位。然而，目前已经报道的工作都是使用传统的代谢或基因表达方法，通过对细胞群体或受感染组织提取液中的产物来进行研究，掩盖了细胞水平的异质性和空间性。单细胞水平的代谢组学可以研究其他方法可能无法研究的细胞功能。细胞中的代谢物反映细胞状态，揭示相关代谢途径的功能。单细胞代谢组学在揭示细胞间的表型差异，特别是细胞的异质性方面具有巨大的潜力。单细胞质谱仪(SCMS)能够描绘单个细胞中的代谢物图谱，并揭示隐藏的细胞亚群。基于MS的单细胞代谢组学能够分析和确定在环境扰动后细胞代谢物的变化。
2.1 实验方法
作者团队开发了一种单探针SCMS(单细胞质谱仪)方法，以获取克氏锥虫感染期间单个细胞的代谢组学数据。单探针SCMS是一种自制的装置，由提供溶剂的毛细管、双孔石英针和Nano-ESI源组成。单探针可与质谱仪连接，用于微尺度采样(例如，单个细胞和组织切片)和MS分析(图1a)。单探针尖端足够小(∼9μm)，可以插入到单个细胞中，采样溶剂连续流动来提取细胞内容物，并通过Nano-ESI MS进行电离分析(图1b)。![]()
图1 (A)单探针单细胞质谱仪(SCMS)装置 (B)实验装置的工作示意图
本实验使用单探针SCMS技术对HeLa细胞进行分析，将其分为三组不同的模型系统：克氏锥虫感染组、旁观者组(即与感染细胞相邻的未感染细胞)和对照细胞(未接触克氏锥虫)。用戊二醛固定细胞以杀灭寄生虫，然后用X-gal对固定的寄生虫进行染色，能够在显微镜下区分包含寄生虫的细胞(包含蓝色无鞭毛体阶段的寄生虫)和旁观者细胞 (不包含蓝色染色区域)（图2a）。在克氏锥虫感染期间，只有少数细胞被感染，但即使在寄生虫负荷较低的情况下，也可能出现CD症状，这些寄生虫可能在空间上与组织损伤部位无接触。用SCMS分析同一培养板上感染和未感染的细胞，与对照组相比，可以从旁观者细胞的感染中揭示克氏锥虫感染的直接效应。
2.2 结果讨论
主成分分析表明，固定和染色过程对整个细胞代谢物图谱没有显著影响，在没有寄生虫感染的情况下，细胞在没有染色固定（Control）和染色（Stained）的情况下有类似的代谢物分布（图2b）。
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图2 固定和染色对感染克氏锥虫的HeLa细胞代谢产物的整体影响
正如预期的那样，与旁观者细胞相比，含有寄生虫的细胞具有不同的整体代谢物成分。然而，这两种类型的细胞在整体代谢组方面与对照细胞和染色细胞(即未感染细胞)不同。这一发现支持克氏锥虫感染对整个细胞代谢组的旁观者效应，并提供了一种代谢机制来解释恰加斯病症状在寄生虫存在较少的部位的发展。PCA结果显示，旁观者细胞的子集与来自同一培养板的感染细胞特别相似(即重叠)(图2b和图3a)。而且使用随机森林机器学习算法，将部分旁观者细胞错误分类为了被感染细胞，通过对这些细胞进行PCA分析，发现错误分类的细胞和感染细胞之间有高度的相似性（图3b）。
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图3 克氏锥虫感染对旁观者未感染细胞代谢组的影响
为了确定感染细胞和两个旁观者组之间具有显著不同丰度的代谢物(正确分类和错误分类感染细胞)，进行了方差分析（表1）。作者从两个独立实验中的所有组中获得了16个离子，旁观者细胞和感染细胞的错误分类具有非常相似的模式(例如，与正确分类的旁观者细胞相比，m/z 267.0620、322.886和359.025的水平较低)。
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表1 用方差分析法测定不同细胞组之间的代谢物
在所有可注释的代谢物中，m/z 756.547被注释为PC(34:3)、LPC(34:4)或PC(O-34:4)。不同细胞组之间的脂类丰度有显著差异，有趣的是，与感染细胞相似，错误分类的旁观者细胞也含有更高数量的这种物质（图4）。![]()
图4 PC(34:3)在三组不同类型细胞中的归一化强度
综上所述，作者使用单探针SCMS技术在单细胞水平上对克氏锥虫异质性感染细胞进行代谢组学研究。这是首次在哺乳动物感染性疾病中实施单细胞代谢组学。作者发现，必要的细胞固定(杀死寄生虫)和染色对整个细胞代谢组没有显著影响。实验结果首次证实了克氏锥虫对感染细胞邻近的未感染细胞的旁观者效应。虽然目前的研究不能完全解释这种旁观者效应的机制，但不均匀感染可能是由于宿主细胞预先存在的异质性。例如，旁观者细胞可能属于宿主细胞亚群，含有支持寄生虫细胞内复制所需的较低水平的营养物质。或者，这些差异可能是在寄生虫感染后，通过感染细胞分泌代谢物或蛋白质重塑旁观者细胞新陈代谢而建立的。该文章的实验结果为恰加斯病的发病机制提供了重要的见解，解释了不含寄生虫部位的病变发展，这对恰加斯病的治疗具有重大意义。
供稿：饶缔
责任编辑：王丹
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.2c02279
文章引用：doi/10.1021/acs.analchem.2c02279
文章信息：Single-Cell Mass Spectrometry Enables Insight into Heterogeneity in Infectious DiseaseTra D. Nguyen, Yunpeng Lan, Shelley S. Kane, Jacob J. Haffner, Renmeng Liu, Laura-Isobel McCall, and Zhibo Yang Analytical Chemistry 2022 94 (30), 10567-10572
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