2022年9月，中国农业科学院油料作物研究所油料品质化学与加工利用创新团队提出了两步法提取油菜籽中酚类化合物的新策略，建立了基于高效液相色谱串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)同时剖析菜籽中酚类化合物的靶向代谢组学方法，并进行了方法学验证。采用两步提取策略和靶向代谢组学结合化学计量学的方法，对六种不同颜色油菜籽及其不同组织部位(种皮、子叶和胚轴)的酚类化合物进行了剖析，以了解不同颜色油菜籽酚类化合物组成、含量和空间分布。本研究为油菜籽中酚类化合物的挖掘与评价以及菜籽中酚类化合物的加工利用提供了理论基础和数据支撑。相关研究成果发表在食品领域国际著名学术期刊《Food Chemistry》（IF: 9.231）上。
创新点
研究背景
研究内容
油菜籽中酚类化合物的分析流程如图1所示。首先，采用传统有机溶剂提取（TOSE）和低共熔溶剂提取（DESE）相结合的两步提取方法：经过TOSE后，用DESE进一步提取油菜籽中的不溶性成分。然后对采用两步提取策略（TSES）提取的酚类化合物进行靶向代谢组学分析，并对建立的TSES-LC-MS/MS方法进行充分的方法学验证。采用主成分分析、层次聚类、热图和相关分析等方法对定量结果进行统计分析后，通过生物信息学分析和菜籽组织中显著差异性代谢物空间分布的分析，研究不同颜色油菜籽酚类化合物组成、含量和空间分布。
图2. (A)总酚含量（TPC）测定的标准曲线；(B)不同提取溶剂对TPC的影响；(C)不同提取溶剂对提取酚含量和酚数量的影响；(D)不同提取条件对油菜籽提取酚含量的影响；(E)不同提取方法对提取酚含量和酚数量的影响；(F)一步提取法和两步提取法提取酚种类和数量的比较。
图3. 本研究所用油菜籽(A)及其颜色(B)。注：L亮度，a红度，b黄度。不同小写字母表示组间差异显著(p < 0.05)， 结果表示为三个生物学重复的平均值±标准差。
该研究分析了六种不同颜色油菜籽（即MG、YH、YN、YY、ELS和HN，如图3A所示）和油菜籽不同组织部位酚类化合物的含量和组成。根据色度计分析结果（图3B），菜籽亮度值（L）从44.00 ± 0.04降至20.73 ± 0.08，红度值（a）从9.45 ± 0.04降至1.05 ± 0.03，黄度值（b）从19.15 ± 0.02降至0.33 ± 0.03按照如下顺序：MG、YH、YN、YY、ELS和HN。
图4. (A)油菜籽中酚类化合物的主成分分析（PCA）得分图；(B)油菜籽中酚类化合物的PCA载荷图；(C)不同油菜籽间酚类化合物的层次聚类热图分析；(D)油菜籽中酚类化合物的相关性热图分析。
不同油菜籽中酚类化合物的PCA得分图如图4A所示，不同油菜籽表现出明显的分离，并根据两种主要成分可清楚地划分为不同的簇。YN油菜籽与其他油菜籽的区别最大，MG、ELS和HN油菜籽聚集较近，表明它们之间具有相似的酚类化合物组成。图4B为PCA载荷图，将得分图与载荷图进行比较发现，YN油菜籽与其他五种油菜籽之间存在显著的分离主要是因为酚类化合物，如表儿茶素、对羟基苯甲酸、水杨酸、阿魏酸、芥子酸、酪醇、canolol、对羟基肉桂酸和香草酸的存在。由于异鼠李素和山奈酚的存在，YH和YY油菜籽与MG、ELS和HN油菜籽表现出良好的分离。如图4C所示，热图能直观地显示出不同油菜籽中各酚类化合物积累的相对丰度，表明不同油菜籽的酚类组成存在显著性差异。通过相关性热图分析进一步研究了各酚类化合物之间的相关性（图4D）。
图5. (A)油菜籽中酚类化合物的VIP得分图；(B)油菜籽中酚类化合物的代谢通路分析；(C)不同油菜籽间酚类化合物种类的韦恩图；(D)不同油菜籽中酚类化合物的空间分布。
油菜籽中酚类化合物的VIP得分图如图5A所示。不同油菜籽中显著性差异酚类化合物可通过 p < 0.05 和 VIP ≥ 1 的标准筛选出来。不同油菜籽显著性差异酚类化合物包括四种，即丁香苷、山奈酚、异鼠李素和芥子酸。使用KEGG代谢通路数据库进行代谢通路分析（图5B），结果表明，不同油菜籽的代谢通路差异，主要为黄酮和黄酮醇生物合成通路、次生代谢物生物合成通路和苯丙烷生物合成通路。韦恩图分析（图5C）表明，六种油菜籽中只有两种公共的酚类化合物，即芥子酸和芥子碱，YN油菜籽中酚类化合物种类最多，MG和ELS油菜籽中酚类化合物最少。
四种显著性差异酚类化合物在菜籽不同组织部位的空间分布特征如图5D所示，结果表明，丁香苷、山奈酚、异鼠李素和芥子酸在不同菜籽品种和菜籽不同组织部位中的分布存在显著性差异。丁香苷在ELS和HN油菜籽的子叶中积累较多，在HN、YN和MG油菜籽的胚轴中的积累高于YH、YY和ELS油菜籽，而在ELS、YN、HN菜籽种皮中的积累高于其他菜籽种皮；YY菜籽子叶中山奈酚含量最高，YN和YY菜籽胚轴中山奈酚含量最高，而YN菜籽种皮中山奈酚含量最高；YY菜籽子叶中异鼠李素含量最高，MG菜籽次之，YH、YN、ELS和HN菜籽子叶中异鼠李素含量较低，YY、YN和HN菜籽胚轴中异鼠李素含量高于MG、YH和ELS菜籽，HN菜籽种皮中异鼠李素含量最高；YN、YY和HN菜籽子叶中芥子酸含量显著高于MG、YH和ELS菜籽子叶，YN菜籽胚轴中芥子酸含量最高，ELS菜籽胚轴中最低，YN和YH菜籽种皮中芥子酸含量显著高于其它菜籽种皮。后续将通过开发非靶向或拟靶向的液相色谱-质谱分析方法，结合生物学研究，进一步探明菜籽颜色和酚类化合物之间的相关性。
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供稿：张瑶
责任编辑：魏芳、肖华明
论文链接：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.134151
