● 1. 研究背景 ●
大麻(Cannabis sativa L.)被人类用作食物、纤维、药物和精神活性物质的来源，最丰富的大麻素是四氢大麻酚酸(tetrahydrocannabinolic acid, THCA)和大麻二醇酸(cannabidiolic acid, CBDA)，分别来源于与THCA合成酶和CBDA合成酶相同的前体大麻萜酚酸(cannabigerolic acid, CBGA)。这些酸性大麻素不稳定，暴露于光、空气或热后可能会失去一氧化碳，产生具有不同生物活性的大麻二酚(cannabidiol, CBD)、Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol, Δ9-THC)和大麻酚(cannabigerol, CBG)。例如，大麻酚(cannabinol, CBN)可能会发生进一步降解，因为在陈年大麻中发现了四氢大麻酚的氧化降解产物。在化学上，这些大麻素大致可分为两类：（1）具有吡喃环的THC类似物;（2）具有二取代双键和第二酚基而不是吡喃环的CBD类似物。由于THCA、CBDA和CBG都是由共同的前体CBGA形成的，许多大麻植物同时含有THCA、CBDA和CBG。此外，在许多筛查和仪器分析中，很难区分来自这些不同群体的不同大麻素。因此，将CBD类似物与THC类似物分开对于防止干扰是必要的。
不断增长的大麻产业和日益增长的法医测试压力推动了便携式、高通量和易于使用的测试的发展，这些测试可以直接在现场进行，用于大麻的定性和定量分析。与依赖于仪器的现场筛选方法相比，比色测试是有吸引力的替代方案，因为它们价格便宜且需要最少的操作培训。然而，在没有任何预分离的情况下，非精神活性的大麻素，如CBD类似物，以及非大麻素也会得到假阳性结果。因此，在显色之前分离单个大麻素是必要的。
为了实现这种分离，已经证明了薄层色谱(TLC)和显色试剂的组合，用于斑点的可视化，从而对大麻进行简单、快速的定性或半定量分析。硅胶和反相(C-18)板这两种系统都为大麻和大麻样品中的Δ9-THC、CBD和CBN提供了良好的分离，但不能充分分离THCA、CBDA和CBGA等酸性大麻素。在其他研究中，对固定相进行了修改，以获得更好的分离效果。
除了使用TLC分离不同的大麻素外，列出的应用还基于使用显色试剂进行定性分析。对于基于TLC的定量分析，研究依赖于使用光电密度计来扫描斑点，不适合无仪器的现场分析。智能手机的便携性、低成本、多功能性和广泛可用性为TLC板的无仪器分析创造了机会。科学工作集中在基于智能手机的定性和定量分析上，并导致了（重）金属、除草剂、杀虫剂、抗生素、生化指示剂、过敏原、细菌、病毒等检测的应用。
本研究的目的是使用带有 Ag(I) 离子的部分改性硅胶 TLC 板来改善 THC 类似物的 TLC 分离，以及通过使用智能手机半定量扫描有色 THC 斑点来改善检测步骤。这种技术组合将允许在温室环境中对大麻品种进行快速、无仪器的现场筛选，或用于溶剂消耗量低的现场法医目的。
Fig. 1. Structures and formation process of important cannabinoids: cannabigerolic acid (CBGA), tetrahydrocannabinolic acid (THCA), Δ9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC), cannabinol (CBN), cannabigerol (CBG), cannabidiolic acid (CBDA), and cannabidiol (CBD).
Fig. 2. Overview of the experimental workflow.
● 2. 结果与讨论 ●
2.1 Ag(I)-TLC与未改进TLC法分离标准品的比较
Fig. 3. THC,CBD,CBN,CBG,THCA,
andCBDA standards (from lefttoright)loaded andseparated on(A)anunmodified
silicagel TLC plateand(B)anAg(I)-TLC plate.
2.2Ag(I)-TLC板的储存稳定性
2.3通过HPLC-MS/MS评估Ag(I)-TLC分离
2.4Ag(I)-TLC与智能手机偶联，用于 THC 类似物的半定量分析
在充分评估了Ag(I)-TLC板的分离性能后，使用智能手机分析对THC类似物进行半定量分析。
校准曲线和LOD: 首先构建了板上负载的THCA、THC或CBN绝对量与饱和值之间的校准曲线，显示出良好的线性（R2= 0.96–0.98），范围为0.2–2 μg，THC 的 LOD 为11 ng，CBN 为 54 ng，THCA为 50 ng。在TLC板上，THC的最低可见量为15.6 ng，CBN为31.3 ng，THCA为31.3 ng，与计算值相似。
通过图像分析区分THC和CBN: 通过应用智能手机校准曲线，可以对样品中的THCA进行单独的半定量分析。然而，由于 Ag(I)-TLC板上的 THC 和 CBN 斑点重叠（图3B），因此 THC 和 CBN 的单独分析具有挑战性。在之前的一项研究中，四氢大麻酚+立方氮化苯的总和已被用于评估初始四氢大麻酚水平，从而间接评估大麻的效力。同样，在这项工作中，使用组合的 THC 和CBN 点从 THC 校准曲线估计 THC + CBN 的总量。由于单个THC和CBN对智能手机信号的贡献略有不同，因此在分析含有各种相对成分的THC和CBN的样品时，可能会出现一些误差。为了研究这一点，通过Ag(I)-TLC板分析了一系列绝对量相同但CBN + CBN比率不同的THC + CBN标准混合物，并将每个斑点的智能手机饱和信号与纯THC斑点的饱和信号进行比较。当CBN/（THC+CBN）比值在0-0.6之间时，饱和信号与纯THC的饱和信号差异不大;然而，当CBN/（THC + CBN）比值大于0.6时，饱和信号约占纯THC信号的70%。在这种情况下，应用仅使用四氢大麻酚的校准曲线来计算四氢大麻酚+立方氮化硼的总含量最终会低估四氢大麻酚+立方氮苯的含量。考虑到新鲜大麻或相关产品通常含有很少的（CBN/（THC + CBN）<0.6），在大多数情况下，这不会导致我们的半定量方法出现问题。然而，由于长时间储存，可能在环境温度下或没有避光保护，样品可能含有较高的CBN含量（CBN/（THC + CBN）>0.6）。因此，研究了智能手机图像分析是否至少可用于确定何时会出现这种情况。该检查基于这样一个事实，即纯 THC 在与FBBB 反应后产生橙色，而纯 CBN 产生紫色。这种高CBN和低CBN样品的区别可以通过RGB颜色分析来实现。简而言之，在ImageJ中测量R和B成分之间的相对差异，并将其归一化为100%THC（1）和100%CBN（0）之间的值。该方法可以识别含有较高（CBN/（THC + CBN）>0.6）比率的样品，因此应用CBN校准曲线是合适的。
（混合）大麻提取物的分析:通过Ag(I)-TLC结合智能手机检测分析混合大麻提取物组1和混合大麻提取物组II。应用THC校准曲线来计算THC + CBN的总含量，因为RGB颜色分析显示大麻提取物的CBN /（THC + CBN）比率小于0.6。计算总 THC 潜在百分比，并将其与峰值总 THC 潜在百分比作图。如图 6 所示，计算出的总 THC 电位百分比与这两组样本的加标总 THC 电位百分比具有良好的相关性（R2= 0.97）。精密度稍差但得到的结果与HPLC – UV结果一致。
Fig. 6. Relationship between total THC potential percentage and normalized saturation of THC analogues.
● 3. 总结 ●
作者在文中描述的 Ag(I)-TLC 智能手机方法可以对总 THCA、THC 和 CBN 进行可靠的半定量分析，有望应用于大麻品种鉴定的快速筛查方法。该方法可以在10分钟内同时分析多个大麻草药样品，只需要几毫升溶剂。不同样品的HPLC-UV与Ag(I)-TLC方法具有良好对应关系，证实了方法的适用性。并且该方法操作简单、运行成本低，是快速检测大麻素含量的理想方法。除此之外，该方法还有望应用于大麻新鲜度鉴定和CBD产品中筛选THC。
编辑：郭梦帅
责任编辑：魏芳
关于我们
中国农业科学院油料作物研究所油料品质化学与营养创新团队脂质分析实验室致力于突破脂质组分析所面临的生物基质复杂、脂质及其代谢产物种类繁多且结构复杂、定性和定量分析困难等共性关键技术瓶颈，建立高效，高通量的脂质组分析平台，并将该平台广泛应用于：（1）不同生物种质资源中脂质组成；（2）应用于食品安全与质量控制；（3）脂质的生物功能与营养学评价；（4）开发新的功能脂质。
