大家好，本周分享一篇发表在LWT (IF:6.0)的文章，题目为“Molecular insights into the loss of phytosterols during the neutralisation of corn oil”。该研究的通讯作者为马传国教授，来自河南工业大学粮油食品学院，研究方向主要是植物油加工过程研究。
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● 背景介绍 ●
植物甾醇是植物油中的特异性成分，有抗炎、降胆固醇和抗癌等益处。食用植物油是膳食植物甾醇的主要来源，其中玉米油的植物甾醇含量高达8070.23 mg/kg。然而植物油在加工中需要一系列的精炼过程，除臭和碱中和过程会导致植物甾醇大量损失。
碱中和是一种有效用于去除植物油中游离脂肪酸的化学精炼工艺，可适用于高稳定性食用油，形成的皂化物通过重力作用从油相中分离出来。中和过程中使用的碱浓度对食用油产量也有一定的影响，低浓度碱可增强乳化作用，而高浓度可导致甘油三酯水解，因此大多数研究都集中在各种植物油的中和参数上。该研究旨在研究不同浓度NaOH溶液中和玉米油过程中植物甾醇在非均相中的分布。采用低场核磁共振谱法(LF-NMR)对皂化物的含水量进行了研究。为了研究植物甾醇的化学转化，研究了NaOH溶液对游离植物甾醇和植物甾醇酯含量的影响。此外，还进行了大量的模拟实验，以确定植物甾醇损失的分子机制并比较损失差异。通过透射电子显微镜(TEM)直接观察了皂化物的形态。最后，通过X射线衍射(XRD)和小角x射线散射(SAXS)分析了NaOH溶液浓度对皂化物结构的影响。
玉米油中游离态植物甾醇和植物甾醇酯的损失结果如图1A、图1B所示，游离态植物甾醇的损失远远高于植物甾醇酯，并且随着NaOH浓度的增加而减少。![]()
图 1.用不同的NaOH溶液中和玉米油后（A）游离态植物甾醇和（B）植物甾醇酯的剩余和损失含量 用NaOH溶液对玉米油进行实验室规模的中和，在80 °C下进行30分钟
为了进一步研究NaOH浓度下游离植物甾醇的损失行为，用正庚烷取代甘油三酯作为模型系统。模型系统中的LF-NMR谱图显示，游离植物甾醇含量（表1-1）随着皂脚中水的含量的增加而增加（图2），这可能归因于水和游离植物甾醇之间的氢键作用，当用26 °Be NaOH溶液中和时，游离植物甾醇的损失增加（图1A）。波美度（°Be）是表示溶液浓度的一种方法，把波美比重计浸入所测溶液中，得到的度数就叫波美度。测得某溶液的波美度后,可从相应的对照表中查出该溶液的质量百分比浓度。表1-1 NaOH溶液浓度对模型体系中剩余游离态植物甾醇的影响![]()
表1-2 在相同中和条件下，NaOH溶液浓度对玉米油在15%过量NaOH溶液中损失的影响
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图2 不同氢氧化钠溶液中和模型体系中皂脚(游离油酸和正庚烷中的游离态植物甾醇)中质子信号振幅的分数
如图3所示，加入26 °Be NaOH溶液后，植物甾醇酯含量有所下降，表明模型体系中植物甾醇酯发生了水解。然而，在添加16 °Be NaOH溶液后，观察到植物甾醇酯含量略有增加(图1B)。![]()
图3用不同浓度NaOH溶液中和模型体系（游离油酸、植物甾醇酯和正庚烷中的三油酸酯）含量的变化
如图4所示，考虑含有游离油酸、三油酸酯和游离态植物甾醇的不同模型体系的影响，加入NaOH溶液后，观察到游离态植物甾醇的酯化作用。当NaOH浓度为16 °Be时，酯化率达到最高。结果表明，随着NaOH溶液浓度的增加，酯化速率增加，而过量的NaOH溶液会导致脂质皂化。此外，加入6 °Be NaOH溶液后，植物甾醇酯含量变化波动最明显(图3)，而游离态植物甾醇的酯交换率的变化最不明显(图4)。这归因于游离态植物甾醇与三油酸酯之间的乳化作用，而不是酯化作用。就植物甾醇酯含量而言，在玉米油中和过程中，酯化和水解部分发生在热均相体系中。![]()
图4不同氢氧化钠溶液中和后模型体系中游离态植物甾醇(游离油酸、谷甾醇和正庚烷中的三油酸酯)的酯交换速率。用氢氧化钠溶液对模型系统进行实验室规模的中和，温度为80 ℃，时间为30分钟
基于植物甾醇的损失（主要是由于物理迁移），研究了碱中和过程中游离态植物甾醇在不同阶段的分布。表2-1列出了作为对照(100%)的脱胶玉米油中各种游离植物甾醇和总游离植物甾醇的含量，以及6-26 °Be NaOH溶液中和后不同阶段各种游离植物甾醇和总游离植物甾醇的比例。表2-1用不同的NaOH溶液中和玉米油，离心后不同相中游离植物甾醇的含量和分布
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当使用6-10 °Be NaOH溶液进行中和时，钠皂中夹杂着中性油且无法通过离心分离，形成了一层厚厚的乳化层。同时，游离态植物甾醇损失最高，含量降至油相中总游离植物甾醇的63.33%±5.80%。当NaOH溶液的浓度增加到12 °Be时，水相和固相在皂脚中分离。NaOH溶液浓度显著影响各相游离植物甾醇的分布(p < 0.05)。通过比较水相和固相中游离植物甾醇的比例，如表2-1所示，可以推断脱胶玉米油中的游离植物甾醇主要在皂脚的固相中损失。然而，随着NaOH溶液浓度的增加，固相中游离植物甾醇的比例降低，这与图1A所示一致。水相中游离植物甾醇的损失归因于游离植物甾醇和钠皂的胶束形成，它们的形态如图5B所示。结果表明，在水洗过程中，油相中的游离植物甾醇会不断流失。![]()
图5（A）分散在正庚烷相中的模型体系皂液和（B）水相以及（C）工厂皂液样品分散在正庚烷相中的TEM照片
根据玉米油中脂肪酸的组成，研究了脂肪酸对游离植物甾醇损失的影响（图6）。在实验室规模的中和过程中，随着油酸钠和亚油酸钠系统中水分含量的降低，游离植物甾醇的损失减少。然而由于棕榈酸钠的溶解度低，其在棕榈酸钠体系中损失最高。碱中和和离心过程中的温度对游离植物甾醇的损失也有显著影响，温度会影响脂肪酸钠盐的溶解度。因此为了减少游离植物甾醇的损失，应根据油脂中脂肪酸的组成来选择中和和离心的温度。![]()
图6 不同脂肪酸(A)游离油酸，(B)游离亚油酸，和(C)游离棕榈酸对不同NaOH溶液在实验室规模的新中和过程中游离植物甾醇损失的影响(6-26 °Be)
与游离植物甾醇含量和植物甾醇酯含量的变化相比，在玉米油中和过程中，游离植物甾醇从油相向皂脚的迁移是导致总甾醇含量损失的关键。XRD分析
通过XRD分析获得了皂脚的结构信息，工厂样品的衍射图与模型系统的衍射图相似(图7)。每个峰反映了双层间距的衍射顺序，根据布拉格定律预测d=2π/q，模型系统表现出双层结构，重复距离为4.203 nm，约为油酸分子长度的两倍。工厂样品中硬脂酸和磷脂的存在可能导致了比模型系统更长的重复距离(4.414 nm)。此外还具有垂直于双层平面的烃链的油酸钠的重复双层距离。![]()
图 7 来自模型系统和工厂样品的皂脚的XRD图谱
皂脚和游离植物甾醇的聚集行为
通过SAXS分析获得了关于所形成的液晶结构的更详细的信息，该分析测量了不同浓度的NaOH溶液和游离植物甾醇（图8)，可以看出，6和12 °Be皂脚的图案分别表现出3个或2个布拉格峰，相对位置比分别为1：2：3和1：2，从而主要表明了层状结构的存在。在NaOH浓度为6和12 °Be时，从第一个布拉格峰计算的晶格间距值分别为14.75和16.00 nm。油酸钠浓度的增加和游离植物甾醇的存在导致有更紧密堆积的复杂分子。然而，26 °Be皂脚的曲线呈现出两个布拉格峰，相对位置比为√2:√4，表明存在立方结构，这意味着随着皂脚中含水量的降低，形成了反立方相，晶格间距减小到7.13 nm。![]()
图 8 用不同NaOH浓度（6,12和26 °Be）中和的皂脚（有/没有游离植物甾醇）的SAXS模式
五、植物甾醇损失机理
通过模拟玉米油的中和过程，发现一种含有胶束和片层的皂脚和植物甾醇的混合物，在室温下加入6 °Be氢氧化钠溶液后得到图9。![]()
图9 用6°Be NaOH溶液中和的皂脚照片
脂肪酸皂的微观结构在加热过程中由片层转变为蠕虫状胶束，以增加溶解度。因此脂肪酸皂的球形、长条形和蠕虫状胶束是玉米油中和过程中最常见的结构。由于玉米油中和过程中的非均相体系，分别在正庚烷和水相中研究了油酸钠和游离植物甾醇的聚集体形态。在这两相中，油酸钠和游离植物甾醇以不同大小的蠕虫胶束形式存在(图5A-B)，类似于工厂样品在正庚烷中的胶束形态(图5C)。随着皂脚含水量的减少，胶束和片层相转变为立方结构，极性头部的面积减少。因此，皂脚中的植物甾醇含量随着氢氧化钠溶液浓度的增加而降低。图10展示了玉米油中和过程中植物甾醇的损失情况。![]()
图 10 玉米油中和过程中植物甾醇损失的示意图
● 总结 ●
在玉米油碱中和过程中，植物甾醇的损失主要归因于游离植物甾醇的界面迁移，并伴有游离植物甾醇与植物甾醇酯之间的轻微化学转化。油相和皂脚的成分分析表明，这两类植物甾醇之间的明显差异可能归因于脂肪酸的钠盐掺入由氢键形成的双分子层中。SAXS实验表明，氢氧化钠溶液的浓度影响极性头部区域皂脚的晶格间距。此外，脂肪酸钠盐的溶解度较低，导致游离植物甾醇的损失较高。因此，氢氧化钠溶液的浓度和中和温度是影响脂肪酸钠盐双分子层内植物甾醇分子迁移的重要因素，该研究为开发健康营养的食用油提供了一定的参考。编辑：苗靖涵
责任编辑：魏芳
文章引用：https://doi.org/10.1016/j.lwt.2021.112767
文章信息：Bai, G.V., Ma, C., Chen, X., Jing, L., & Yan, Y. (2022). Molecular insights into the loss of phytosterols during the neutralisation of corn oil. LWT.
中国农业科学院油料作物研究所油料品质化学与营养创新团队脂质分析实验室致力于突破脂质组分析所面临的生物基质复杂、脂质及其代谢产物种类繁多且结构复杂、定性和定量分析困难等共性关键技术瓶颈，建立高效，高通量的脂质组分析平台，并将该平台广泛应用于：（1）不同生物种质资源中脂质组成；（2）应用于食品安全与质量控制；（3）脂质的生物功能与营养学评价；（4）开发新的功能脂质。
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