摘要
大家好，本周分享一篇2022年5月发表在Metabolic Engineering的文章，题目是” Diverting phenylpropanoid pathway flux from sinapine to produce industrially useful 4-vinyl derivatives of hydroxycinnamic acids in Brassicaceous oilseeds”。本篇文章的通讯作者是来自洛桑研究所植物科学部的Peter Eastmond教授，主要研究方向是油籽代谢和发育。
Highlights
报道了一种减少油料作物中芥子碱的方法
将有害的芥子碱转移成为有益的羟基肉桂酸4-乙烯基衍生物 新的方法不会影响油料作物的产量和种子质量
壹
背景介绍
芸苔属植物通过苯丙素通路的一个支路积累了大量的芥子酰基酯。在油菜中，芥子碱主要在胚发育过程中累积，其含量可达种子干重的2%。在种子萌发时，芥子碱代谢形成芥子酰苹果酸酯，并储存在幼苗发育期的子叶中。芥子酰苹果酸酯和其他酚类物质被认为具有保护通气组织免受紫外线B辐射的功能。然而，油菜籽和其他芸苔属油籽中存在的芥子酰基酯导致这些富含蛋白质的油籽粕不适于用作动物饲料。芥子碱具有苦味，且降低蛋白质消化率。为提高油籽粕的营养价值，一般认为需要将芥子酰基酯含量降低至2 mg g-1干重以下。油菜籽中芥子碱含量一般在3.4 ~ 12.9 mg g-1，因此一些研究利用靶向遗传修饰代谢通路基因来降低芥子碱水平。目前，通过基因沉默或诱变可在油菜籽中单独或联合破坏7个芥子碱合成酶相关蛋白编码基因。然而，这种方法不能降低芥子酰基酯水平，并且会导致种子产生一些难预料的生化和表型变化。
本研究的目的是确定芸苔属油籽中羟基肉桂酸中间体流量是否可分流用于生成4-乙烯基苯酚衍生物（4-VPs），替代原本抗营养的芥子酰基酯。从而，作者设想能够从油籽中提取4-VPs作为油料加工中可持续增值副产品。而每年大约有7000万公吨油菜籽被加工。包括短小芽孢杆菌菌株UI-670，已在100多种细菌中鉴定出无辅因子酚酸脱羧酶（PAD）基因，其中一些已克隆并表征。虽然该酶对一系列4-羟基肉桂酸具有活性，包括4-香豆素酸和阿魏酸，但它不能以芥子酸作为底物。Morley等利用X射线晶体结构结合活性位点的饱和诱变，成功地将短双歧杆菌PAD底物特异性扩展到包含芥子酸。异亮氨酸85替代丙氨酸（I85A）导致芥酸脱羧酶活性约为阿魏酸的60%。因此，作者决定研究在亚麻荠中这种改良的I85A版本的矮小双歧杆菌PAD对种子特异性过表达的影响。亚麻荠是一种芸苔属油料作物，正在开发为一系列高价值食品和非食品产品的生产平台。亚麻荠非常适合基因工程，并且已知其籽粕中含有芥子酚酯。
图1.A schematic diagram of the main pathway of sinapoyl ester biosynthesis in Brassicaceous seeds.
贰
实验方法
作者将携带I85A置换的改良短双歧杆菌PAD基因在亚麻荠中的表达进行密码子优化，并由Genewiz公司合成。然后使用Q5-TAQ聚合酶（NEB）和引物PAD-F和PAD-R通过PCR（聚合酶链反应）扩增开放阅读框。使用凝胶提取试剂盒（Promega）纯化PCR产物，并使用EcoR1和Xho1（Promega）消化。pBinGlyRed2也用EcoRI和Xho1消化，碱性磷酸酶处理（Promega），凝胶纯化，并使用T4 DNA连接酶（NEB）将PAD连接到载体中。然后如前所述生成转基因亚麻荠系。将该载体转化到根癌农杆菌菌株AGL1中。在不施加任何真空的情况下，将亚麻荠花序浸入农杆菌悬浮液中30秒。使用配备有DsRed（红色荧光蛋白）过滤器的Leica M205荧光立体显微镜筛选从转化植物收获的种子以表达DsRed标记蛋白。然后使用Qiagen Plant RNeasy试剂盒（带RLC缓冲液）提取RNA。上标III试剂盒（Invitrogen）用于产生cDNA。将cDNA进行标准化和定量PCR。使用LighCycler 96软件和Qbase+（Biogzelle）分析数据。使用核磁和UPLC-MS对代谢物进行分析。
叁
实验结果
3.1种子特异性启动子下表达PAD的转基因亚麻荠株系的建立
在亚麻荠种子发育过程中表达PAD，作者通过植物密码子优化合成了一个携带I85A替换的改良短小芽孢杆菌基因，并在强种子特异性甘氨酸启动子控制下将其克隆到pBinGlyRed载体。使用农杆菌通过花浸法转化植株，选择40多个表达荧光DsRed标记蛋白的杂合T1种子，并培养产生分离的T2种子。在温室中培养至T3代，获得纯合子种子批次。通过定量RT-PCR检测4个纯合子株系的种子中PAD的表达，结果表明PAD的表达量高达2.5倍，而野生型(WT)种子中未检测到PAD的表达。
图2.Quantitative RT-PCR analysis of PAD expression in seeds from ProGLY:
PAD lines grown in the glasshouse.
3.2 PAD的表达降低了种子中芥子碱的含量并产生乙烯基衍生物
为分析ProGLY:PAD系种子中可溶性酚类化合物，用80%甲醇提取4个纯合子株系的4个植株和野生型（WT）对照植株，然后进行1H-NMR分析。在四个独立的ProGLY:PAD系中，芥子碱含量显著(P < 0.0001)降低了95%。为了确认4-VPs的积累不是由pBinGlyRed载体中DsRed标记蛋白的表达引起的，我们还对表达DsRed的控制线进行了1H-NMR分析，未检测到具有烯烃化学位移信号物质。
表1. Sinapine and 4-VP derivative content of seeds from ProGLY:PAD lines grown in the glasshouse and in the field.
3.3 PAD表达产生多羟基肉桂酸的糖基化4-乙烯基衍生物
为分析ProGLY:PAD系种子代谢物变化，作者利用1H-NMR和LC-MS/MS进行了极性和非极性提取物分析。。负电离模式高分辨率LC-MS\/MS中ProGLY:PAD种子的无偏代谢组学分析表明，四个独立纯合ProGLY:PAD系中的每一个都可以与WT分离和LC-MS\/MS数据的差异分析显示了119种具有统计学意义（P<0.05）的上调（对数2倍变化>1）代谢物特征。在手动处理以去除同位素峰、加合物和碎片离子后，47个上调的代谢物特征解释了WT和ProGLY:PAD种子之间的差异。对准确质量数据和特征MS\/MS片段的检查表明，存在一组差异取代的4-VP衍生物，这些衍生物基本上不存在于野生亚麻荠种子中。
图3.Multivariate analysis of LC-MS/MS data (negative ionisation mode) following extraction of field grown seeds of ProGLY:PAD lines and WT controls in aqueous methanol. A, Principal Component Analysis scores plot indicating separation of transgenic lines in the direction of PC1 (43.6%); B, Differential analysis indicating upregulated (Log2fold change >1 and P < 0.05) metabolite features in the red box and downregulated (Log2fold change < −1 and P <0.05) in the green box.
3.4 PAD的表达导致额外苯丙素衍生物的下调
利用高分辨LC-MS/MS的代谢组学分析ProGLY:PAD种子表明其代谢产物特征下调(Log2 fold change >1)和上调特征均有统计学意义(P < 0.05)。这些下调代谢物中最丰富的是芥子碱。作者用1H-NMR定量WT田间生长的种子中其含量为~5 μmol g-1 DW。与WT相比，ProGLY:PAD种子中其他下调代谢物含量远低于芥子碱。MS/MS分析证实这一点，即m/z 223 (C11H11O5)离子被检测到。虽然不能单独从MS中识别出所有的特性，但其中几种是芥子酰基糖苷。也有证据表明，在一组下调代谢物中也存在类似的阿魏酰基糖苷。
图4. Compositional analysis of styrene analogues in seeds from field grown ProGLY:PAD lines. A, Comparison of aromatic substitution patterns; B, Comparison of substituent types. Data derived from curated LC-MS/MS peak area data.
3.5 PAD表达对种子品质和产量无不利影响
为了确定在温室生长条件下亚麻荠种子中PAD的表达是否会影响种子产量和品质，作者测定了每个基因型在单株盆栽中生长的8株的千粒重(TGW)、含油量和单株种子产量。在WT与四个独立纯合子ProGLY:PAD系之间，TGW、含油量、收获指数和种子产量方面均无显著差异(P > 0.05)。田间采集的种子形态均正常，发芽试验也无显著差异(P > 0.05)。
表2. Seed quality and yield measurements from ProGLY:PAD lines grown in the glasshouse and in the field.
肆
结论
在本研究中，作者研究发现在温室和田间，通过细菌PAD的种子特异性异源表达，亚麻荠种子中芥子碱(和总芥子酰基酯)的含量可以降低95%以上，而且种子中会积累4-VPs（主要以单糖基化和二糖基化类似物的形式存在）。这些4-VP糖苷的摩尔数量是野生型种子中芥子酰基酯的两倍以上。这表明苯丙素途径的通量随着PAD的增加而流向了芥子碱外的其他代谢通路。我们对多个亚麻荠ProGLY:PAD株系的分析表明，在温室和田间条件下，PAD的表达不会对种子重量、形态、水分或含油量、萌发或产量产生不利影响。
供稿：赵志聪
负责编辑：肖华明
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ymben.2022.01.016
文章信息：Guillaume N. Menard , Mollie Langdon, Rupam Kumar Bhunia, Aishwarya R. Shankhapal, Clarice Noleto-Dias , Charlotte Lomax , Jane L. Ward , Smita Kurup , Peter J. Eastmond(2022). Metabolic Engineering.Volume 70,2022,Pages 196-205,ISSN 1096-7176.
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中国农业科学院油料作物研究所油料品质化学与营养创新团队脂质分析实验室致力于突破脂质组分析所面临的生物基质复杂、脂质及其代谢产物种类繁多且结构复杂、定性和定量分析困难等共性关键技术瓶颈，建立高效，高通量的脂质组分析平台，并将该平台广泛应用于：（1）不同生物种质资源中脂质组成；（2）应用于食品安全与质量控制；（3）脂质的生物功能与营养学评价；（4）开发新的功能脂质。
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实验方法
