2024年5月29日，中国农业科学院油料作物研究所油料品质化学与加工利用创新团队在核心期刊《中国油料作物学报》上发表了题为《基于智能手机识别的薄层色谱法快速检测油菜籽中的叶绿素》的研究性论文。郭梦帅硕士研究生和李泽一硕士研究生为本文的共同第一作者，魏芳研究员为本文通讯作者。
该研究将智能手机采集图像与薄层色谱法相结合，提出了一种快速检测油菜籽中叶绿素含量的分析方法，检测过程中无需使用大型仪器，有利于在实际生产中推广和应用。
油菜作为我国主要的油料作物之一，在我国种植面积广泛，是菜籽油的主要来源。叶绿素作为光合作用的色素，在油菜的生长发育过程中有着不可替代的作用。我国大部分地区采用油菜机械收获的方式，由于油菜植株分枝多、同一植株上的角果成熟度不一致、成熟果荚易炸裂，为了减少机收损失，在油菜植株70%角果呈黄色时便进行机械收获，使得收获的部分油菜籽中叶绿素含量偏高，油菜籽中的叶绿素增加了脱色制油的成本，叶绿素光降解产生的自由基导致油脂氧化酸败，缩短了产品货架期，降低了菜籽油的营养品质和外观风味。在美国和加拿大对油菜籽的分级系统中，叶绿素含量是油菜籽分级的重要参考指标。由此可见，叶绿素含量是油菜籽重要的品质指标，开发一种简单、快速准确的叶绿素定量分析方法，对于油菜籽以及菜籽油品质鉴定具有重要的意义。当前，叶绿素传统测定方法主要包括紫外分光光度法（ultraviolet-visible spectrophotometry, UV）、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC、荧光分光光度法（fluorescence spectrophotometry, FL）、近红外光谱法（Near Infrared Spectroscopy, NIR）、液相色谱质谱联用法（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）、高光谱成像法（hyperspectral imaging, HIS）等。这些方法所使用的检测仪器成本较高、对样品的前处理较为复杂，需要一定的实验操作基础。近年来，图像识别与图像处理等技术的应用提升了传统分析方法的应用潜力，传统的TLC定量分析往往需要薄层色谱扫描仪对经激发后能发射荧光的色谱斑点进行扫描，然后将扫描得到的谱图和积分数据用于目标物的定性定量分析。然而，TLC图像中含有检测样品中物质含量等信息，将智能手机图像采集及分析技术与薄层色谱相结合，相比传统的TLC法简化了设备的分析要求。本研究利用智能手机采集叶绿素经激发后发射荧光的TLC荧光斑点图像，利用Image J软件自动计算斑点面积，将荧光斑点图像转换数值信息，建立叶绿素含量和荧光斑点面积的线性关系，从而实现叶绿素的定性定量分析，所建方法具有操作简单、便捷、快速的优点，为快速、低成本的现场视觉检测提供了潜在的应用前景。
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图1 智能手机结合薄层色谱的叶绿素a和b测定方法示意图
如图1所示，本研究对叶绿素a、叶绿素b标品以及油菜籽提取液等进行薄层色谱点样，展开分离后用紫外线分析仪365 nm进行照射，在紫外光照下，叶绿素会显色出紫红色的荧光斑点，对比Rf值即可对叶绿素a和叶绿素b进行定性，将显色的薄层色谱板用智能手机拍照，通过Image J软件处理自动识别荧光斑点并得到面积，建立用于实际样品检测的标准曲线。通过该方法对所测样品进行薄层色谱的分离、图像采集、软件分析，带入建立的线性关系中，即可计算出样品中叶绿素含量。标准曲线的建立结果如图1所示，叶绿素a和b在0.04~1.00mg/mL范围内的线性良好，其中，叶绿素a的回归方程为Y=5403.6X+3031，相关系数R2为0.9965，叶绿素b的回归方程为Y=3358.7X+2611.1，相关系数R2为0.9925。检测过程仅使用2μL的提取液便可进行定量分析，表明该快速定量检测方法具有较好的灵敏度。![]()
图1 叶绿素a和叶绿素b定量检测标准曲线
精密度
连续测定三天，计算得到方法的日内精密度（一天内重复3次）和日间精密度（三天内重复3次），以RSD%表示，结果如表3所示，日内日间精密度均小于10%，说明该快速定量检测方法具有良好的重复性。![]()
油菜籽样品的加标回收测定
为了验证实验的准确性，对油菜籽样品中的叶绿素进行了加标回收试验，结果如表4所示，油菜籽中叶绿素a和叶绿素b的加标回收率均在80%~120%的可行范围内，表明该方法的准确度良好，满足分析要求。![]()
不同型号的智能手机的测定误差
为了探究不同手机采集斑点图像对测定结果的影响，本研究对比了三款不同后置摄像头的智能手机采集同一块薄层色谱板上不同浓度的叶绿素a和叶绿素b对照品溶液点样后的斑点图像，斑点1~3是叶绿素a浓度为1、0.6、0.3 mg/mL的斑点，斑点4~6是叶绿素b浓度为1、0.6、0.3 mg/mL的斑点，测定结果由表5可知，不同型号的智能手机获取的图像RSD均小于10%，证明了该方法在不同的智能手机上使用时具有高重复性和稳定性，为该方法的推广和使用奠定了基础。![]()
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油菜籽样品的定量检测结果
选取不同品种不同收获时期的油菜籽（图2a），按照1.2.6所述方法进行前处理和分析测定，如图2b所示，在4月21日收获的六个品种油菜籽中叶绿素总含量在230.05 mg/kg ~ 347.25 mg/kg之间，随着油菜籽的成熟，油菜籽中的叶绿素含量会逐日降低，5月16日收获的油菜籽中叶绿素含量逐渐降低到17.33 mg/kg ~ 25.04 mg/kg，测定叶绿素的趋势变化与相关文献相一致。其中，前四个收割日期中的油菜籽叶绿素降解速率较快，从5月11日开始，叶绿素降解速率减小，直至日期六叶绿素总量小于30 mg/kg，此时的菜籽趋于成熟。在同一收获时间，不同品种之间的叶绿素含量存在差异，但六种品种油菜籽中叶绿素a和叶绿素b的变化趋势相一致。由图2b和图2c所示，日期一到日期四，油菜籽中叶绿素a的含量始终高于叶绿素b，日期五和日期六收割的油菜籽中叶绿素b的含量高于叶绿素a，这与油菜籽中叶绿素a和叶绿素b降解速率有关。该方法可以检测出不同发育期的油菜籽叶绿素含量，且与现行标准方法相比，均可对叶绿素含量低于30mg/kg的油菜籽进行检测，满足了对油菜籽叶绿素的检测要求。![]()
图2 不同成熟度油菜籽图像以及其中叶绿素变化趋势图（n = 3）
智能手机因其先进成像和处理技术被广泛用于采集分析待测物的图像信息，使得智能手机成为分析测定的主要工具，本研究建立的方法简化了设备要求，操作环境简单，相较于传统的检测方法，本研究耗时短、仪器成本较低，检测结果与国家标准方法一致性较高。此外，本研究可进一步设计出专用的拍照装置，用以降低环境光及拍照角度等因素对图像质量的影响，也可以建立模型、优化背景扣除和系统校正算法，使得定量检测结果更加便捷、准确。
综上所述，本研究建立了一种基于智能手机的薄层色谱法快速检测叶绿素含量的分析方法，智能手机便于现场采集图像，且该方法对不同型号的智能手机兼容性较强，不同型号智能手机对测定结果影响较小，仅需保证图像采集和图像处理物质测定过程中使用同一部手机即可。该研究为测量油菜籽中的叶绿素提供了一种简单、准确和便捷的方法，有利于在实际生产中广泛推广和应用，未来可以结合机器学习图像预测等技术，实现更高效率的现场视觉检测，也为叶绿素现场快速检测分析提供了参考。
上述研究得到了国家自然科学基金(U21A20274)、国家重点研发计划专项(2021YFD1600103)、湖北省自然科学基金创新群体项目(2023AFA042)、农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室开放课题(KF2023008)、中国农业科学院创新工程项目(CAAS-ASTIP-2013-OCRI)、农业农村部基本科研业务费(1610172023021)等项目的资助。
另外，我们实验室开发了一款与薄层色谱法相关的定量分析软件，该APP的功能使用介绍可参考下方视频。
供稿：郭梦帅
责任编辑：魏芳
论文链接：https://link.cnki.net/doi/10.19802/j.issn.1007-9084.2023299
中国农业科学院油料作物研究所油料品质化学与营养创新团队脂质分析实验室致力于突破脂质组分析所面临的生物基质复杂、脂质及其代谢产物种类繁多且结构复杂、定性和定量分析困难等共性关键技术瓶颈，建立高效，高通量的脂质组分析平台，并将该平台广泛应用于：（1）不同生物种质资源中脂质组成；（2）应用于食品安全与质量控制；（3）脂质的生物功能与营养学评价；（4）开发新的功能脂质。
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