知道蛋白组学前处理步骤多，没想到这么多。
根据样本类型，大概可以分为固体（如组织）和液体（血浆和尿液等）。根据实验要求，可以分为不去高丰度蛋白和去高丰度蛋白，去除高丰度蛋白测到的蛋白数量是不去的6倍以上。不管去不去，都有第一步提取总蛋白。
1) 提取总蛋白
a) 固体样本首先需要低温研磨（如果组织样本里面含有血浆等，需要先用PBS清洗干净，以免血液中的蛋白质对组织蛋白造成污染），在加入8M尿素裂解液（含PMSF蛋白酶抑制剂和辅助膜破坏的EDTA），超声破碎，离心取上清，即得到了总蛋白样本溶液。为保障样本的均一性，需要用BCA试剂盒测每个样本的总蛋白含量，然后每个样本取30微克的总蛋白含量，并用酶解液统一定容到100微升（质谱仪不一样，取的蛋白总量不同）。
2）不去除高丰度蛋白
拿到蛋白溶液后，对蛋白溶液进行：
还原（打开半胱氨酸的二硫键）：加入DTT试剂，37度水浴还原45min，保障PH是碱性；
烷基化（半胱氨酸巯基添加修饰基团，以防止再次形成二硫键）：冷却到室温后，加入IAM，避光震荡15min；
蛋白酶解：加入TEAB和胰蛋白酶，37度水浴过夜。加入20%的FA溶液调节PH为3，涡旋离心取上清；
肽段除盐：用zip-tip除盐柱。
3）去除高丰度蛋白（选做——不去除高丰度蛋白样本均一性更高，稳定性更高，更接近样本的真实情况，去除后能检测到的蛋白质更多）
此处可使用商品化的试剂盒——易肽DeeP低丰度富集试剂盒，官网有SOP，照着做即可。此步骤取1）中得到的总蛋白溶液，按照试剂盒中的石墨烯低丰度蛋白富集、磁珠清洗、裂解、还原烷基化、酶解、除盐完成后，用BCA微量肽段定量方案检测肽段浓度后，取肽段，冷冻干燥，用0.1%甲酸水溶液复溶即可上机检测了。
4）超微量样本的蛋白提取
如样本中蛋白含量低于10微克，那需要用Sisprot SE Kit试剂盒，一站式处理，集成提取、酶解、脱盐为一体；可用于几个细胞的蛋白提取，官网有SOP，照着做即可。
注意事项：还原和酶解这二步，在加入液体离心过程中不能使柱料完全干，要保持柱料上有1-2mm的液面。
此次学习的二种质谱仪可能是目前最高端的二款仪器，各有所长：
1）Thermo Scientific™ Orbitrap Astral 质谱仪
去年刚刚发布的，在以往仪器的基础上开发了新一代质量分析器--不对称轨道无损质量分析器（asymmetric track lossless，Astral）。看不太懂，但是通俗一点的理解就是，跟以前的仪器相比，现在的仪器离子可以在不对称离子镜经过24-26次反射，总轨道路径长度超过30米，分辨率高达80000（@ m/z 524）。DIA（Data Independent Acquisition）的分析隔离窗口可以窄到2 Da（其他品牌的仪器一般都是25以上）。如果MS1的范围是400-900 Da，二级的离子窗口可以设置为2 Da，那就可以分为250段去打二级质谱，分段越多，在DIA采集模式下，碎片峰的归属就更准确，定性的准确度就越好。所以这个仪器还是很无敌的。能有这么快的扫描速度，那么一个样本的采集时间最低能到8min，一天就是180个样本，通量极高。
2）Bruker tims TOF Pro 2
这台仪器的扫描速度没有上面那台高，但是它的优点是有双捕集离子淌度（TIMS）和同步累积连续碎裂（Parallel Accumulation Serial Fragmentation，PASEF）数据采集模式两大创新技术。啥意思呢，就是离子从离子源出来后，先在TIMS1里面累计一下，那本来离子浓度不够的离子，累计一下后浓度增加，就能检测到峰了。累计后在第二个TIMS里面，调节电压后，可以根据离子的碰撞面积CCS（我理解的离子淌度碰撞面积原理是，离子质量相同的情况下，根据离子形状差异来分离）。依次流出的离子去打二级质谱。相当于增加了一个维度的分离，所以称之为4D蛋白组学（保留时间、质荷比、离子强度和离子淌度）。在DIA的采集模式下，维度越多，碎片峰的归属就更准确，那定性的准确度也会相应提高。并且在第二个TIMS流出后，第一个TIMS又开始进行下一步的离子累计，使得离子的利用率也大大提高了。
跟代谢组学比起来，蛋白组学的前处理有多复杂，数据的定性定量就有多简单。因为蛋白质的组成就是氨基酸，氨基酸的结合方式固定，根据软件就可以排列组合出所有的可能性，再进行匹配即可。
数据分析首选的软件是DIA-NN，数据参数设置如下图所示，然后提交就可以得出来鉴定到的蛋白、肽段和峰面积了（适用于常规的蛋白组学，磷酸化修饰等不包含再内，虽然上面可以选部分修饰，但是培训老师说不太好用）。
最后感谢迈维代谢提供这次全面细致的培训！
