● 背景介绍 ●
在美国，大豆油是必需多不饱和脂肪酸(PUFAs)，亚油酸(LA , C18:2n-6)和a-亚麻酸(ALA, C18:3 n-3)的主要来源，常用于食品加工(即油炸、烹饪)，而加热处理可以氧化PUFAs。LA和ALA的氧化产生初级氧化物，称为氧化脂类，已在室温储存的各种油中检测到了该类氧化物。已有研究表明，在油脂的热加工过程中，脂质氧化物的浓度增加。
在大豆毛油中，脂肪氧化的主要底物是三酰甘油(TAGs)和游离脂肪酸(FFAs)，分别占油脂的95-97%和0.3-0.7%。研究表明，TAGs和FFAs在油热处理过程中发生氧化。如图1所示，这些底物在加热油中产生氧化脂类的可能途径有两种：(1) TAGs可以发生非酶水解产生FFAs，后者可以氧化形成游离的氧化脂类(蓝色为Pathway 1)，或者(2) TAG分子(即酯化脂肪酸)中的脂肪酸可以发生氧化反应生成TAG结合氧化脂类(即酯化的氧化脂类,如Pathway 2中红色所示)。含有结合氧化脂类的TAGs随后可以分解生成游离的氧化脂类(红色为Pathway 2)。游离或酯化的氧化脂的非酶分解可以产生被称为"二次挥发物"的二次氧化产物。
一般来说，第一种涉及FFA生成的机制被认为是脂质氧化的主要原因。样品中FFA含量变化反映了更多的TAG水解成了FFAs，释放的FFAs形成初级氧化产物(即氧化脂类)和次级挥发物的潜力更大。然而，在油脂中，TAGs和FFAs中均检测到脂肪酸氢过氧化物，表明氧化可以直接发生在TAGs上，也可以在FFAs从TAGs释放后发生，脂质氧化的首选底物仍不明确。
在该研究中，该课题评估了TAGs或FFAs是否是大豆油脂质氧化的首选底物。作者开发了一种分离和水解油中酯化氧化脂类的方法，并测定了加热24 h的大豆油中游离和酯化(主要是TAG )脂质氧化物的生成速率。同时测定了FFA的水解速率。为了确定观察到的速率是否依赖于不同的前体底物的量(例如, TAGs比FFAs在油中更集中)，每个前体底物形成产物的速率。作者推测，由于TAGs作为氧化底物在油脂中大量存在，TAG氧化物的形成和转化(即单位底物浓度的反应速率)的速率将快于FFAs。
采用超高效液相色谱-串联质谱法( UPLC-MS/MS )测定了不同大豆油体积( 1、2、5、10 uL)经Na2CO3水解后总LA和ALA衍生氧化脂类的浓度。如表1所示，单因素方差分析(ANOVA)和Tukey 's post-hoc检验表明，1 uL大豆油(约1 mg)中脂氧化物浓度显著高于其他体积的样本。
Table 1 Concentrations of total linoleic acid (LA)-derived and α-linolenic acid (ALA)-derived oxylipins in different volumes of soybean oil (pmol/μL).
实验二比较不同碱对大豆油的水解效率
如图2 所示，非配对t 检验分析表明LA来源的13- HODE, 12(13)-EpOME, 9(10)-EpOME, 9,10-DiHOME和ALA来源的9-HOTrE。与Na2CO3水解相比，NaOH水解的氧化物浓度提高了18% - 521%。NaOH水解后LA衍生和ALA衍生氧化物的总量提高了187%和67%，由于NaOH水解样品中的峰强度大于Na2CO3，d-11-11(12)-EpETrE), d11-14,15-DiHETrE, d4-9-HODE, d4-LTB4, d6-20-HETE和d8-5-HETE的代谢物回收率，在NaOH水解样品中显著高于Na2CO3。
总的来说，NaOH比Na2CO3更有效地水解结合态氧化脂类。
Fig. 2 Concentrations of total linoleic acid (LA)-derived and α-linolenic acid (ALA)-derived oxylipins in 1 μL soybean oil hydrolyzed with sodium carbonate or sodium hydroxide. Data are expressed at mean ± SD of n = 5 per base type. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001 by unpaired t-test.
实验三 SPE分离脂肪酸的油样体积优化
如表2 所示，与1 uL油相比，游离的9-HODE, 13-HODE, 9-oxo-ODE, 12(13)-EpOME和9,10-DiHOME在2、 5和8 uL油中显著降低。游离态9(10)-EpOME浓度在不同油脂体积之间无显著差异。LA衍生的9,10,13-TriHOME仅在2 uL体积的样本中检测到。5 uL和8 uL中检测到了ALA衍生的9-HOTrE，但未在更低的体积中检测到。游离LA来源的氧化脂类总量在1uL油中明显高于2、5和8uL(p<0.05)，有显著差异。
实验四 加热对脂肪酸和脂氧化物浓度的影响
表3 展示了24 h加热期间总(游离+酯化)和游离氧化脂质中的脂肪酸含量。与最初相比，总脂中的脂肪酸随加热时间没有显著变化。在24 h时，LA和ALA在初始(0 h)、4 h或8 h (p<0.05)相比，增加了1.3至2.4倍。FFAs的总量，在24 h时增加了约2倍。加热0-8 h，FFAs占总脂肪酸的比例均小于1 %；在24 h时，FFAs增加至总脂肪(p<0.05,见表3)的1.6 %，有显著差异。表4显示了初始(0 h)和100℃加热1 h，4 h，8 h和24 h时大豆油中总的和游离LA衍生和ALA衍生氧化脂类浓度。总脂氧化物浓度是游离氧化脂类的339-440倍(表4)。在总脂质氧化物中，LA来源氧化脂类的浓度比两个ALA来源氧化脂类的浓度高30-105倍。
随着加热时间的推移，9-HODE 在8 h和24 h的浓度较最初，1 h和4 h升高了135%-463%。与0、1和4 h( p<0.05)相比，13-HODE在8 h时增加了129-159%；24 h时比其他时间点高418-667%，但差异不显著。13-oxo-ODE在8 h时高于前一时间点，在4 h时显著高于0和1 h(p<0.05)。对于9-oxo-ODE，除了在1 h 时的浓度高于初始浓度(p<0.05)外，也观察到了相同的趋势。ALA衍生的13-HOTrE在4 h比 0和1 h高133-149%，处理8 h后，比之前的时间点高。LA和ALA来源的氧化脂类在8和24 h高于其他时间点的128-597%(p<0.05)。
在游离脂肪酸中，12(13)-EpOME浓度在24 h比初始、1 h和4 h增加了约6倍 (p<0.05)。与8 h相比，24 h时LA氧化物的总和增加了169% (p<0.05)。而游离态脂氧化物占总脂氧化物的0.2 - 0.3 %，各时间点之间没有显著差异。
FFA水解及LA和ALA氧化动力学
Fig. 3 Velocity and turnover of free palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid (LA), and α-linolenic acid (ALA) hydrolysis in soybean oil heated for 24 h. Velocity (a) and turnover (b) data are expressed at mean ± SD of n = 5 per fatty acid. Different superscript letters are significantly different by one-way ANOVA followed by Tukey’s post-hoc test (p < 0.05). FFA, free fatty acid.
采用One-way ANOVA和Tukey ' s post-hoc检验比较大豆油中检测到的5种主要FFAs的水解和转化速率。如图3 所示，LA的水解速率明显大于棕榈酸、硬脂酸、油酸和ALA的水解速率，分别为的4.9、12.1、2.6和8.8倍 (p<0.05)。油酸的水解速率明显大于硬脂酸和ALA，分别是的4.6倍和3.4倍，但与棕榈酸无显著差异。方差分析表明，各种脂肪酸之间的转化率没有显著差异，这表明在单位底物中，所有脂肪酸都以相似的速率从TAGs中水解，总脂氧化物的生成速率与酯化氧化脂类的生成速率相近，因为酯化氧化脂类占总脂氧化物的主要部分(> 99.7 % ) (表4 )。采用非配对t检验比较游离和酯化脂氧化物的形成/降解速率，以测试FFAs或TAGs是否是生成氧化脂类的首选底物。如表5 所示，酯化LA衍生的9-HODE，13-HODE和9-oxo-ODE的生成速率(速率)显著大于游离9-HODE，13-HODE和9-oxo-ODE的生成速率，分别为的1300倍 (p<0.05)，416倍和520倍。酯化的氧化物中LA来源的氧化脂类之和的速率是游离的265倍 (p<0.05)。
通过将脂氧化物生成速度归一化到每种脂类中(自由或结合)内的前体脂肪酸底物浓度来确定转化率。总氧化脂类的转化率与酯化氧化脂类相当。如表5所示，酯化LA衍生的9-HODE的转化率显著高于游离9-HODE 的转化率（28倍）。其他个别LA氧化物(如13-HODE，9-oxo-ODE等)和LA来源的氧化脂类之和的转化率在酯化物中也大于游离态，尽管这些变化在统计上不显著，可能是由于组间的高变异性。总的来说，这些数据表明，酯化的TAGs优先于FFAs被氧化，更利于结合态氧化脂类的生成。
● 总结 ●
FFAs是目前测定油脂或食品样品中脂质氧化的行业标准，因为它们可能比TAGs更容易发生自动氧化、热氧化或光氧化。研究中，尽管在24 h加热期间FFA水解速率更高(图3)，但TAGs比FFAs产生氧化脂类的速度更快。该研究使用的动力学模型存在局限性。首先，它没有捕捉到如图1所示的其他氧化反应，尤其是TAG结合的氧化脂类直接释放生成游离的氧化脂类的过程，或者由于形成次级挥发性化合物而导致游离或结合氧化脂类的损失。
未来的研究需要使用标记的酯化和游离PUFA示踪剂，来准确测量特定氧化脂质类的转化率。本研究证明，在加热过程中，与FFAs相比，TAGs优先被氧化形成氧化脂类。这表明在油脂中，脂质氧化的机制涉及TAG作为首选底物被利用，而不是FFAs。因此，与游离氧化脂类或FFAs相比，TAG结合的氧化脂类可能成为食品或油脂体系中更好的脂质氧化标志物。
编辑：覃佐剑
责任编辑：魏芳
文章引用：https://doi.org/10.1038/s41538-021-00086-3.
文章信息：Shen, Q., Zhang, Z., Emami, S., Chen, J., Leite Nobrega de Moura Bell, J. M., & Taha, A. Y. (2021). Triacylglycerols are preferentially oxidized over free fatty acids in heated soybean oil. NPJ science of food, 5(1), 7. https://doi.org/10.1038/s41538-021-00086-3.
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