大家好，本周分享一篇2024年7月发表在Analytical Chemistry 的文章，题目为“Efficient Strategy for Characterization and Quantification of
Polyunsaturated Lipids by Microwave-Assisted MMPP Epoxidation”。该研究的通讯作者是华南理工大学生物科学与工程学院的周婷副教授，研究方向为手性药物分析、药物代谢、手性药物立体选择性代谢及手性转化研究等。![]()
脂质在生命活动中起着不可或缺的作用，碳-碳双键（C═C）的数量和位置显著影响脂质的生物学功能。不饱和脂质的精确表征和定量对于发现疾病生物标志物至关重要。质谱（MS）因其高灵敏度、高选择性和能够提供结构信息的能力而成为定位不饱和脂质 C═C 的主要工具。新开发的离子激活技术可以产生指示 C═C 位置碎裂的诊断离子，包括紫外线光解离、臭氧诱导解离，低温等离子体和自由基诱导解离。在这些方法中，化学衍生化策略与质谱相结合最有利于精确定位不饱和脂质中的 C═C，包括臭氧分解、环氧化、Paternò-Bǜchi反应和 N-甲苯磺酰氮化等。然而，上述方法仍然存在一些缺点，包括需要复杂的仪器改造以及反应转化率有限；此外，几种同时具有多个 C═C 键的不饱和脂质异构体的存在也使得解释结果变得困难。
本研究开发了一种微波辅助的邻苯二甲酸镁六水合物（MMPP）环氧化反应，结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的方法来分析不饱和脂质。微波辐照加速了 MMPP 环氧化，在 10 分钟内实现了完全衍生化，无副产物，16 Da 质量差的诊断离子对有效地确定了C═C键在质谱中的位置。此外还实施了纯化工艺以去除过量的衍生化试剂，显著减少了对质谱响应抑制并提高了分析重现性。最后，该方法应用于表征和定量与 I 型糖尿病相关的大鼠血浆中的不饱和脂质，更深入地剖析了不饱和脂质对相关疾病的生理影响。
基于微波辅助 MMPP 环氧化工艺与 LC-MS/MS 相结合的不饱和脂质分析机理如图 1 所示。MMPP 作为氧化剂，诱导不饱和脂质中 C═C 键环氧化生成环氧化物，微波辐照提高了环氧化反应效率。环氧化后，将一个氧原子（16 Da）添加到每个 C═C 键中。随后，通过 LC-MS/MS 分析环氧化物，得到的诊断离子质量增加 16 Da。这些离子对应于醛和乙烯基团，准确地确定了不饱和脂质中的原始 C═C 位置。![]()
Figure 1. Mechanism of microwave-assisted MMPP epoxidation and CID-MS/MS for producing diagnostic fragment ion pairs.以脂肪酸（FA）18:2（9Z，12Z）为例，如图2a所示，质谱分析显示环氧化产物仅在 [M+2O-H] −= m/z 311.22，表明 FA 18:2（9Z，12Z）中的 C═C 键都是环氧化的。碎片离子（[M+2O–H2O–H]− = m/z 293.21）是在环氧化产物中通过碰撞诱导解离（CID）损失水分子后出现的。此外，如图2b所示，在Δ9处观察到两个环碎裂得到的诊断离子对m/z 211.14和227.13，每个离子对分别是 16 Da 的质量差异。同样，在环氧化和 CID 之后，FA 18:3（9Z、12Z、15Z）的环氧化产物产生了丰富的诊断离子，能够确定它们的 C═C 位置（Δ9 处的m/z 的155.11和171.10;Δ12处的m/z为 211.13和227.13;Δ15 处的 m/z 267.16 和 283.16）。如图2c所示，在 FA 20:4（5Z、8Z、11Z、14Z）的情况下，观察到环氧化产物产生的四对诊断离子（Δ5的 m/z 为99.05和115.04；Δ8的m/z为155.07和171.07；Δ11的m/z 为211.10和227.09；Δ14的 m/z 为267.12和283.12）。以上质谱分析表明，最靠近羧基的 C═C 键产生的碎片离子占主导地位且丰度更高，这可能归因于较低的焓或熵势垒，从而产生更稳定、能量更低的环状过渡态。在 FA 20:4（5Z、8Z、11Z、14Z）的情况下，由于其所有的 C═C 键都是环氧化的，因此 MS/MS 谱图变得比单环氧化产物的谱图更复杂。然而，由于生成了独特的完全环氧化产物，因此使 LC-MS/MS 的定量分析得到了简化。Figure 2. Identifying C═C positions in polyunsaturated lipids via MMPP epoxidation: (a) FA 18:2 (9Z, 12Z), (b) FA 18:3 (9Z, 12Z, 15Z), and (c) FA 20:4 (5Z, 8Z, 11Z, 14Z).此外，衍生试剂 MMPP 是一种水溶性盐，过量时会降低质谱响应，在脂质环氧化产物色谱峰之前，未经纯化即可观察到显著的氧化剂干扰峰（图3d）。本研究考察了不同纯化方法在去除过量 MMPP 方面的效果。将水、饱和 NaCl 溶液和饱和 NaHCO3溶液分别加入反应液中，然后使用乙酸乙酯萃取有机相。水（图3b）和饱和 NaCl 溶液（图3c）都无法有效去除反应溶液中的氧化剂，反而导致脂质环氧化物的提取效率降低。图3a 表明，使用饱和 NaHCO3不仅显著降低氧化剂干扰峰，环氧化物的质谱响应还更接近于在反应溶液中的响应（图3d），表明环氧化物几乎完全提取。可能的原因是额外的 MMPP 与 NaHCO3形成盐，它保持在水相中，随后在萃取过程中被去除。![]()
Figure 3. EIC plots for different purification methods: (a) Saturated NaHCO3 solution, (b) water, (c) saturated NaCl solution, and (d) no purification. Peaks 1–7 represent epoxidation products of FA 18:3 (9Z, 12Z, 15Z), FA 18:2 (9Z, 12Z), FA 16:1 (9Z), FA 18:1 (9Z), PC 18:0/20:4 (5Z, 8Z, 11Z, 14Z), PC 18:1 (9Z)/18:1 (9Z), and PC 16:0/18:1 (9Z), respectively.与传统的热传导方法不同，微波辐照通过加速分子运动和反应物之间的碰撞来提高反应速率。此外，研究结果表明，微波照射显著提高了具有多个 C═C 键的多不饱和脂质的环氧化效率，尤其是在磷脂酰胆碱（PC）中（图4b），这是因为PC具有大磷酸头基和脂肪酰基链特征，表现出比FA明显更大的空间位阻，而微波照射受空间位阻的影响较小，可以加速分子间的运动和碰撞。假设不饱和脂质及其环氧化产物之间的电离效率一致，评估了微波辅助 MMPP 环氧化的产率，本方法实现了高反应产率（多不饱和脂质为 >85%，单不饱和脂质接近 100%）。此外，在研究过程中发现，具有多个 C═C 键的不饱和 FAs 中的环氧化在每个 C═C 键处都是非选择性的，传统的环氧化方法仅限于对单个 C═C 键进行环氧化，形成多个单环氧化产物，因此定量复杂化。如图4d ，当多不饱和脂肪酸 FA 20:4（5Z、8Z、11Z、14Z）发生单环氧化反应时，它们会产生各种单环氧化产物，这导致色谱图中在同一 m/z 319.23 处出现多个峰，使分析复杂化。在这种情况下，有必要对所有单环氧化产物的峰面积求和以获得绝对定量，这很复杂且容易出错。本研究中建立的方法成功地实现了 FA 20:4（5Z、8Z、11Z、14Z）中所有 C═C 键的环氧化，得到完整的环氧化产物，m/z 367.21 处的唯一色谱峰证明了这一点（图4c）。因此，事实证明，所建立的方法在环氧化多不饱和脂质中的所有 C═C 键方面更有效，有助于绝对定量。![]()
Figure 4. Comparative analysis of lipid epoxidation
products. (a) Comparison of peak areas for epoxidation products from
microwave-assisted and conventional epoxidation after a 10 min reaction time.
(b) The relative intensity of lipid epoxidation products with varying numbers
of C═C bonds in microwave-assisted epoxidation versus conventional epoxidation.
EIC plots of (c) the complete epoxidation product and (d) monoepoxidized
products of FA 20:4 (5Z, 8Z, 11Z, 14Z).
最后，作者使用该方法定量分析了I型糖尿病模型大鼠血浆中的不饱和脂质。和先前研究一致，糖尿病大鼠血浆中观察到脂质水平变化，如其中脂肪酸水平上调，且FA 18:1(11Z)、FA 16:1(9Z)（*）、FA 18:2(9Z, 12Z)、FA 18:3(9Z, 12Z, 15Z)和FA 20:4 (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) 显著增加，而PC 16:0/18:1 (9Z)、PC 18:0/20: 4 (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) 和溶血磷脂酰胆碱(LPC) 18:1
(9Z)/0:0 的浓度显著降低。SCD1将FA 16:0（*）转化为16:1(Δ9)（*），而ELVOL6将 FA 16:1 (Δ9) （*）延伸至 FA 18:1 (Δ11)。因此，糖尿病大鼠血浆中FA 18:1 (Δ9) 和 FA 18:1 (Δ11)水平的增加可能归因于细胞内SCD1和 ELOVL6酶的活性增强。FA 18:2 (Δ9,Δ12) 是包括前列腺素在内的炎症脂质介质的前体，糖尿病患者血浆中FA 18:2 (Δ9,Δ12) 的上调表明该疾病可能会引起机体的炎症反应。![]()
Figure 5. Comparative analysis of lipid profiles in
rat plasma. (a) Lipid content in control and model groups (n=8).
(b) Heatmap illustrating variations in unsaturated lipids between control and
model groups.
此外，利用该分析方法监测脂质 C═C 位置异构体变化的能力，还可进一步挖掘识别疾病的生物标志物。例如，所有含 C18:1 的脂质中广泛存在Δ9/Δ11 异构体对。对 5 种含 C18:1脂质的分析显示，它们在亚类水平上无明显差异；但在C═C位置异构体水平上，有四个异构体对的比例出现显著变化。例如，LPC 18:1 具有两种主要的C═C异构体：LPC 18:1 (Δ9) 和 LPC 18:1 (Δ11)。尽管这两种异构体的总量没有显示出显著变化，但两种异构体的相对含量在糖尿病模型鼠血浆和对照组中有显著差异。因此可见，表征不饱和脂质的C═C位置对糖尿病代谢途径的研究有重要意义。![]()
Figure 6. LC-MS/MS isomeric lipidomics analysis of
lipid C═C isomers in rat plasma. (a) Relative quantitation of five
C18:1-containing lipids at the subclass level in two groups. (b) Comparative
isomer compositional analysis of C18:1 Δ9/Δ11 in two groups. Statistical
significance indicated by *P < 0.05, ** P <
0.01, *** P < 0.005; ns: no significant differences; I indicated
intensity.
● 总结 ●
本研究开发了将微波辅助 MMPP 环氧化反应与 LC-MS/MS 耦合的方法，用于不饱和脂质的定量和定性分析。微波辐照显著提高了多不饱和脂质的 MMPP 环氧化反应效率，将各种不饱和脂质转化为完全环氧化产物，从而简化了色谱分离并促进了准确定量。此外，纯化步骤显著减少了过量氧化剂对质谱响应的抑制，从而提高了质谱灵敏度和可重复性。随后，通过分析 I 型糖尿病模型大鼠血浆中的不饱和脂质，证明了所建立方法的可行性，此外，观察到四种Δ9/Δ11 异构体对的相对丰度的显著变化与糖尿病密切相关。总之，这种简单有效的方法在分析复杂样品中的不饱和脂质方面显示出巨大的前景，在研究脂质对相关疾病的生理影响方面具有广泛的应用潜力。
编辑：严红云
责任编辑：魏芳
文章引用：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.4c00410
文章信息：Huang L, Huang M, Zhou T. Efficient Strategy for
Characterization and Quantification of Polyunsaturated Lipids by
Microwave-Assisted MMPP Epoxidation[J]. Analytical Chemistry, 2024, 96(28):
11189-11197.
中国农业科学院油料作物研究所油料品质化学与营养创新团队脂质分析实验室致力于突破脂质组分析所面临的生物基质复杂、脂质及其代谢产物种类繁多且结构复杂、定性和定量分析困难等共性关键技术瓶颈，建立高效，高通量的脂质组分析平台，并将该平台广泛应用于：（1）不同生物种质资源中脂质组成；（2）应用于食品安全与质量控制；（3）脂质的生物功能与营养学评价；（4）开发新的功能脂质。
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