大家好，本周分享一篇2024年3月发表在Analytical Chemistry 的文章，题目为“Shotgun Lipidomic Profiling of Sebum Lipids via Photocatalyzed
Paternò–Büchi Reaction and Ion Mobility-Mass Spectrometry”。该研究的通讯作者为瑕瑜教授，清华大学化学系教授，研究方向主要是生物大分子质谱，气相离子化学，脂质组学。
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● 背景介绍 ●
皮脂由皮脂腺分泌，它具有保护和滋润皮肤及毛发的作用，主要由非极性脂质组成，包括蜡酯（WEs）、角鲨烯、脂肪酸（FAs）、三酰甘油（TGs）、二酰甘油（DGs）和胆固醇酯（CEs）等。近年来，研究发现阿尔茨海默病和帕金森病患者的皮脂谱发生了改变，皮脂样本的非侵入性收集使其成为一种发现远端器官病理过程生物标志物的理想来源。然而，皮脂脂质组的分析受到了方法学的限制。传统的分析方法如气相色谱-电子电离质谱（GC-EI-MS）需要脂质皂化和甲基化来增强样品的挥发性。而气相色谱串联质谱（GC-MS）、反相液相色谱（RPLC）与电喷雾电离质谱（ESI-MS）或大气压化学电离质谱（APCI-MS）联用等方法虽然对完整皮脂脂质的分析更为直接，但仍然局限于总组成和链组成水平，未能提供详细的结构性见解，尤其是关于双键（C=C）位置的具体信息。针对以上限制，作者开发了一种光催化电荷标记的Paternò−Büchi（PB）反应，以提高WEs和皮脂脂质组中其他中性脂质的电离效率。PB-MS/MS进一步允许在C=C位置水平以脂肪酰基/醇链特异性的方式对不饱和WEs，DGs，TGs和CEs进行分析。利用循环离子迁移谱( cIMS )对同分异构体和同分异构体脂质的快速分离能力，建立了结合PB-MS / MS的鸟枪分析工作流程，并用于人体皮脂脂质的深度剖析。
首先，为了提高WEs和其他非极性皮脂的ESI离子化效率，首先对一系列带电荷标记的PB试剂进行了测试，并筛选了几种光催化剂，同时Scheme 1b以不饱和WE为例，总结了PB-MS2和MS3 CID下C=C诊断离子的形成。在裂解位点上带有带电烯烃官能团的C=C诊断离子在MS2CID的下标中用'O'表示，如在FO或fO中。上标，即n-a或n-d，表示C=C在n-之后的位置。n-a FO和n-d FO的MS3CID分别产生ΔbAO/ΔbAO#和ΔcLO/ΔcLO#。上标Δb或Δc表示Δ-命名后C=C的位置，而"#"表示ΔbAO#中的烯酮结构或ΔcLO#中的失水。根据上述的具体裂解规则，可以精确定位在单个脂肪醇和脂肪酰基中C=C。![]()
Scheme 1. (a) A
Workflow Consisting of Offline Charge-Tagging PB Reaction, a Sample Clean-up
Procedure to Remove Excess PB Reagent, and MS Analysis; (b) Fragmentation
Pathways via PB-MS/MS Lead the Formation of C=C Diagnostic Ions from a Generic
WE Lipid Consisting of an Unsaturated Fatty Acyl (FA) Chain and an Unsaturated
Fatty Alcohol (FOH) Chain.
Fig.1以WE18:0/18:1
(Δ9) (由FOH18:0和FA181: (Δ9) (同分异构体1 ,Fig.a)组成)为例，展示了电荷标记的PB反应和PB - MS / MS现象。用优化的PB反应条件进行反应，在所有测试的PB试剂中，与先前报道的电荷标记PB试剂相比，EP显示出最高的反应效率(Fig.S1)，MK是比[Ir(dF(CF3)ppy)2(dtbpy)]PF6催化效果更好，因为激发三重态的寿命增加了10倍(20 μs)。此外，由于MK在ESI中没有很好的电离，与金属催化剂相比，它表现出很少的化学干扰。Fig.1b数据所示，电荷标记的PB衍生化可以提高WE脂质的离子化效率。WE 18:0/18:1 (Δ9 ) ( [PB1+H ] +,
m/z 714.6, Fig.1c)的PB-MS2CID产生n-9FO和n-9fO，C=C在n-9，PBC18:1 (m/z 444.3)为酯键断裂产生的烯酮类碎片离子。然而基于这些片段，利用PB-MS2CID分析C=C位置时，所分析的脂质中仅能存在一种类型的不饱和链。因此，当分析脂质中存在多种同分异构体时，需要对n-9FO离子进一步进行研究，cIMS-MS提供了一种伪MS3功能，即所谓的时间对齐-平行-裂解(TAP)。Fig.1d为WE 18:0/18:1 ( Δ9 )的PB-MS2CID形成的碎片离子的迁移图，表明主要碎片峰被IMS很好地分离。n-9FO的TAPMS3CID由于酯键的断裂产生了A型离子Δ9AO和Δ9AO# (Fig.1e)。根据PB-MS2和PB-MS3的CID信息，可以确定该结构为WE 18:0/18:1 (Δ9) (同分异构体1)。作为比较，WE 18:1 (Δ9 ) /18:0 (同分异构体2 )PB-MS2和MS3CID的影响。其PB-MS2CID谱图(Fig.1f)与同分异构体1 (Fig.1c)几乎完全相同，只是出现了PBFOH 18:1 (m/z 448.3)而不是PBC18:1 (m/z 444.3)。此外，来自同分异构体2的n-9FO离子(m/z 572.5)与来自同分异构体1的n-9FO具有相同的m/z值，导致C=C在特定链中的位置不确定。同分异构体2的n-9FO的TAP-MS3CID由于C18:0的中性烯酮损失而产生Δ9LO (Fig.1g)，对于同分异构体2，我们可以确定类脂结构为WE 18:1 (Δ9)/18:0。WE 18:1 (Δ9) / 18:1 (Δ9)的PB-MS/MS也可以地鉴定出FA 18:1和FOH 18:1中的Δ9 C=C位置 (Fig.S2)。此外，作者还进行了C=C位于不同链中的脂质异构体的定量，通过将WE 18:0/18:1 (Δ9)和WE 18:1 (Δ9)/18:0两种异构体以10-90 %的摩尔百分比混合，进一步评估了PB-MS/MS定量WE异构体的能力。这一发现表明，链状异构体的摩尔组成可以从TAP-MS3CID中生成的C=C诊断离子中定量（Fig.1h）。同时作者还用 PB-MS/MS 来分析角鲨烯、甘油脂和胆固醇酯的标准品，实现了高 PB 反应产率（~80%）。PB-MS/MS 提供了其链特异性C=C位置及其互补的脂肪酰基链组成。![]()
Figure 1. (a)
The chemical structures and fragmentation maps of a pair of chain composition
isomers, WE 18:0/18:1(Δ9) (Isomer 1), and WE 18:1(Δ9)/18:0 (Isomer 2). (b) EICs of 500 μM WE 18:0/18:1(Δ9) (m/z 535.6, gray trace) before the PB reaction
(diluted 10 times for analysis) and the PB products of WE 18:0/18:1(Δ9) (m/z 714.6, black trace) (diluted 100 times for
analysis). (c) PB-MS2 CID of WE 18:0/18:1(Δ9) ([PB1 + H]+). (d) IMS of
the fragment ions formed in panel (c). (e) TAP-MS3 CID of n-9FOformed in panel (c). (f) PB-MS2 CID of WE 18:1(Δ9)/18:0 ([PB2+H]+). (g)
TAP-MS3 CID of n-9FO formed in panel (f). (h)
Zoomed-in TAP-MS3 CID of n-9FO from an
equimolar mixture of Isomers 1 and 2. (i) A plot of relative ion abundances of
the diagnostic ions (%I1) against its %mole (%C1) of
Isomer 1.在建立鸟枪PB-MS/MS工作流程中，作者发现除了鸟枪分析中经常遇到的II型干扰外，PB衍生化还为皮脂脂质分析引入了额外的同位素干扰。通过研究，作者发现cIMS分离可以有效减少这些干扰。以WE 18:1 (Δ9)/18:1(Δ9)(WE 36:2)和WE 18:0/18:1(Δ9)(WE
36:1)混合物为模型体系，同位素分布分析表明，II型干扰可由cIMS分离前的60 %降至IMS分离后的4% (Fig.3d)。DG 36:1([PBM +H]+,理论m/z 802.6191)的PB产物与CE16:1([PBM+H]+ ,理论m/z 802.6343)的PB产物等压，但只需一次cIMS即可实现分离。![]()
Figure 3. (a) PB-MS1 spectrum of a 5:1
mixture of WE 18:1(Δ9)/18:1(Δ9) (WE 36:2) and WE 18:0/18:1(Δ9) (WE 36:1)
without cyclic IMS separation. (b) EIMs of m/z 714.6 after 10 passes of cyclic
IMS separation. The +2 Da isotope of PBWE 36:2 and the monoisotope
of PBWE 36:1 PB are Gaussian deconvoluted and traced in orange and
blue, respectively. (c) Mobility-resolved MS1 spectrum isolated from
the arrival time of 237–242 ms in (b). (d) %Interference of +2 Da in the MS1spectrum via cyclic IMS off, IMS on, and RPLC separations.随后作者建立了用于分析从皮脂中提取的脂质的分析工作流程（Scheme 2）。从人的额头上收集皮脂，再用甲醇提取油脂，通过RPLC-APCI-MS在总组成水平上对WE脂质进行分析，在对其他脂类物质进行进一步分析之前，采用薄层色谱法（TLC）去除角鲨烯。随后，离线的光催化电荷标记PB衍生化和cIMS-MS/MS被用于在C=C位置水平上分析WE、甘油酯和CE（Scheme 2b）。![]()
Scheme 2.
Workflow for Deep Profiling of Sebum Lipids at Detailed Structure Levelsaa(a) Sebum lipids were collected, and then RPLC-APCI-MS1 was
used to profile WEs at the sum composition level. (b) SQ was removed by TLC;
the rest of the sebum lipids were profiled via PB-MS/MS.其次，为了实现链特异性C=C位置异构体的鉴定和定量，进行了n-xFO的TAPMS3-CID。基于ΔyAO和ΔyLO碎片离子，计算了各链特异性C=C位置异构体的相对丰度（Fig.4a）。不同脂质类别的PB产物(WE、CE、TG和DG)在单次cIMS分离后，到达时间和m/z值之间也显示出特征性的相关性（Fig.4c）。此外，经过一次cIMS分离后，由于DG、CE和完整TG的PB产物之间存在显著的结构差异（Fig.4e），可以清晰地分离出PB产物之间的等压线。通过利用TAP-MS3的CID能力，能够在WE 36:1的单一总和组成中识别出31种不同的结构，PB-MS/MS揭示了比先前已知的WE更巨大的结构多样性。![]()
Figure 4. (a)
Relative quantitation of WEs at the sum composition level via APCI-MS in
positive ion mode (N = 3). (b) Distribution of WEs containing different degrees
of unsaturation based on ion abundances in APCI-MS. (c) Arrival time
distributions of PB-derivatized sebum lipids. (d) Arrival time distributions of
PB-derivatized WEs. (e) EIM of m/z 802, including PB products of DG 36:2 ([PBM+H]+,
m/z 802.612), PB products of CE 16:1 ([PBM+H]+, m/z
802.632), and intact TG 47:4 ([M+NH4]+, m/z 802.688). (f)
MS2 CID of PB-derivatized WE = 36:1 ([PBM+H]+,
m/z 714.6). (g) EIMs of n–xFO formed in (f). (h) Relative
compositional analysis of various isomers of WE 36:1.Fig.5a 进一步总结了WE 36:1的各个异构体的相对丰度。Fig.5b 展示了单不饱和WEs到链特异性C=C位置水平的相对丰度的热图。颜色代码表示在给定的WE配方中，每个特定的单不饱和链在所有异构体之间的相对组成。相应的饱和链长可以通过从总链长中减去不饱和链的长度来推导。一般来说，含有单不饱和FOH链的WEs的相对丰度低于含有单不饱和FA链的WEs的相对丰度。在本研究中，30个不饱和WEs的PB-MS2CID产生了292对CC诊断离子；其中，199个诊断离子产生了高质量的TAP-MS3CID数据，鉴定了500个链特异性C=C异构体。![]()
Figure 5.
(a) The profile of 31 isomers of WE 36:1 in human sebum. (b) Heatmap showing
the relative abundances of monounsaturated WEs in human sebum, with structures
characterized at the chain-specific C═C location level.● 总结 ●
在本文中，作者开发了一种光催化电荷标记的PB反应体系，该体系能够有效地衍生化皮脂脂质。PB-MS/MS进一步实现了对单一分子式中共存的链组成和C═C位置异构体的区分。通过将PB-MS/MS和循环离子迁移质谱（cIMS-MS）集成到鸟枪法分析流程中，实现了比传统反相液相色谱-串联质谱（RPLC-MS/MS）方法更快的皮脂脂质的全面分析。在链特异性与C=C位置水平上，从五类皮脂脂质中鉴定出超过900种脂质，即蜡酯（WE）、角鲨烯（SQ）、二酰甘油（DG）、三酰甘油（TG）和胆固醇酯（CE）。尽管这些脂质的生物学意义需要进一步研究，但该方法在皮脂脂质的基础和临床研究具有较大意义。
编辑：严红云
责任编辑：魏芳
文章引用：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.4c00141
文章信息：Hengxue Shi,Yu Xia. Shotgun Lipidomic Profiling of
Sebum Lipids via Photocatalyzed Paternò–Büchi Reaction and Ion Mobility-Mass Spectrometry[J]. Analytical Chemistry, 2024, 96: 5589-5597.
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