大家好，本周分享一篇2024年6月发表在Analytical and Bioanalytical Chemistry的文章，题目为“Deep profling of plasmalogens by coupling the Paternò–Büchi derivatization with tandem mass spectrometry”。该研究的通讯作者为瑕瑜教授，清华大学化学系博士生导师。
![]()
● 背景介绍 ●
缩醛磷脂是甘油磷脂的一个特殊亚类，在甘油主链的sn-1位置含有乙烯醚键（-C=C-O-），并且它们通常在sn-2位置富含多不饱和脂肪酰基。缩醛磷脂的极性头基主要为磷酸乙醇胺和磷酸胆碱，分别形成磷脂酰乙醇胺型缩醛磷脂（PE-P）和磷脂酰胆碱型缩醛磷脂（PC-P）。缩醛磷脂约占人脂质组总磷脂质量的15-20%，超过50%的PE-P分布在脑、心脏、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞中。缩醛磷脂参与炎症信号转导，与神经退行性疾病、癌症等多种疾病有关。电喷雾电离串联质谱（ESI-MS/MS）是脂质组学分析的核心技术，因为它能够以高灵敏度识别和定量混合物中的复杂脂质。然而，由于各种类型的同位素和异构体的干扰，缩醛磷脂的分析具有挑战性。目前基于二级碰撞诱导解离（CID）的方法仅可区分互为同分异构体的PE-P与PE-O，但难以区分PC-P和PC-O。另外，已有技术对缩醛磷脂C=C双键水平上的鉴定灵敏度不足。使用丙酮作为PB试剂的Paternò-Büchi反应结合串联质谱技术（PB-MS/MS）因存在较高程度的副反应，导致灵敏度不理想(100 nM)，需要进行二次衍生化以提高检测限。此外，目前缺乏一个完整的PB-MS/MS工作流程可以同时实现PE-P和PC-P的分析。针对以上存在的分析挑战，作者开发一套简单、灵敏的工作流程，可以从复杂样品中深度分析PC-P和PE-P。
作者首先评估了几种PB试剂（Fig. 1a）。以PE P-18:0/18:1(Δ9Z) (5 μM) 和 PC P-18:0/18:1(Δ9Z) (2 μM)作为标品，PE 14:0/14:0 (5 μM) 和PC 14:0/14:0 (2 μM)作为内标。在紫外光的激发下，PB反应涉及PB试剂的激发态羰基与C=C键之间的[2+2]环加成。在缩醛磷脂的情况下，乙烯基醚C = C键和脂肪酸上的C=C键都可以形成PB产物。随后的MS2 CID可以裂解PB产物中的四元氧杂环丁烷环，形成C=C诊断离子FA和FO，上标Δx或n-y分别表示C=C在Δ命名法或n命名法之后的位置（Fig. 1c）。![]()
Fig.1. a A list of PB reagents tested for plasmalogens. b A generic structure of plasmalogen with the headgroup (HG) being either phosphocholine or phosphoethanolamine. c A simplifed diagram for the PB reaction of a plasmalogen lipid and the formation of C=C diagnostic ions by PB-MS2 CID.Fig. 2a显示了在优化的反应条件下使用triFAP作为PB试剂的PE P-18:0/18:1（Δ9 Z）的反应光谱。单一PB衍生化产物（[PBM+H]+，m/z 904.7）占主导地位，伴有18%的连续PB反应产物（[2PBM+H]+，m/z 1078.7）。[PBM+H]+的MS2 CID（Fig. 2b）在Fig. 1c所示的碎裂途径之后产生丰富的C = C诊断离子。例如,Δ1FO（m/z 650.4）和Δ1FA（m/z 508.3）对应于与乙烯基醚链中的C = C形成的PB产物的断裂。这些离子可以经历磷酸乙醇胺头基（-141 Da）的顺序损失，由“*”表示，例如，Δ1FA*（m/z 367.3）。鉴于在sn-2链中存在另一个C = C键，相应的C = C诊断离子Δ9FO/Δ9FO*和Δ9FA/Δ9FA*也存在。此外，对应于乙烯基醚链（p18:0，m/z 392.4）和脂肪酰基链（C18:1，m/z 339.4）的离子也很丰富，允许从单个PB-MS/MS光谱中同时鉴定链组成和C = C位置。考虑两个参数来评估PB试剂用于分析缩醛磷脂的性能：PB产率%和C = C诊断离子的相对丰度。PB产率%可通过将反应后PB产物的提取离子色谱图（EIC）归一化为UV照射前完整脂质的EIC来估计。在所测试的八种PB试剂中，triFAP产生最丰富的C = C诊断离子（35%，归一化为PB-MS2 CID中碎片离子的总丰度），显著高于来自丙酮（19%）（Fig. 2c）和其他试剂。与丙酮（3%）和EP（0.5%）相比，triFAP产生了更丰富的分离的C = C键的诊断离子（7%）。总体而言，triFAP表现出用于PE P-18:0/18:1（Δ9 Z）的详细结构分析的最佳性能。值得注意的是，衍生自乙烯基醚C = C的PB产物是C18:1中C = C的PB产物的约三倍，这与其在PB反应中的高反应性一致。PC-P的PB反应的优化反应溶剂体系与PE-P脂质的反应溶剂体系略有不同，其中不需要添加IPA。Fig. 2d中以PC P-18:0/18:1（Δ9 Z）为例说明了反应谱图，而PB产物（[PBM+H]+，m/z 946.7）的CID数据见Fig. 2e。与乙烯基醚C = C和脂肪酰基C = C相关的C = C诊断离子都形成，从而可以可靠地鉴定两个C = C键。磷酸胆碱头基离子（HG，m/z 184.1）和脂肪酰基链相关离子C18:1（m/z 504.5）提供了头基和链组成的信息。乙烯基醚C = C相关PB产物约为酰基C = C PB产物的2倍，与PE-P脂质略有不同。triFAP表现出最高的PB产率%（37%）和最高的C = C诊断离子形成。triFAP还产生比丙酮（2%）高得多的酰基链碎片离子（18%），从而促进链组成的分析（Fig. 2f）。这些数据表明，triFAP可以在C = C位置水平上提供对各种类型的缩醛磷脂的更灵敏的鉴定。![]()
Fig. 2. Principle of PB-derived reactions.
随后作者建立了用于分析从生物样品中提取的缩醛磷脂的HILIC-MS/MS工作流程。在第一次运行中，在HILIC-Q-TOF MS平台上以种属水平对脂质进行分析（Fig. 3b）。在物种水平上用头基、碳总数和双键数的定义信息对其进行注释。这里，PE-O/PC-O是指所有醚型PE/PC。基于HILIC-MS1数据中的相对离子丰度，在物质水平上实现了单个PE-O和PC-O的相对定量。在第二次运行中，对脂质提取物进行离线triFAP PB衍生化，然后进行HILIC-MS2 CID（Fig. 3c）。乙烯基醚C = C键的诊断离子（Δ1FO/A）提供缩醛磷脂的鉴定，而其他n-yFO/A离子提供C = C位置水平的注释。另外，基于Δ1FO/A 离子的相对丰度进行给定缩醛磷脂物质的链组成异构体的相对组成分析，而基于n-yFO/A离子的相对丰度进行C = C位置异构体的分析。![]()
Fig. 3. The workfow for profling of plasmalogens at detailed structural levels.
通过此工作流程，作者对复杂生物样品中的缩醛磷脂进行了分析。Fig. 4a显示了在HILIC运行牛心脏脂质的TIC图。Fig. 4b和c分别显示了正离子模式下PE（6.0-7.0 min）和PC（10.5-11.6 min）的MS1谱图。然后对triFAP衍生的牛心脏脂质进行HILIC-MS2 CID，鉴别了缩醛磷脂以及脂肪酸链上双键的位置。成功在牛心脏全脂中鉴定出73种PE-P 和31种PC-P。![]()
Fig. 4. The PB-MS/MS results of plasmalogens in bovine heart.
.
随后通过特征碎片丰度在链组成水平和C=C双键水平上实现了相对定量（Fig. 5）。![]()
Fig. 5. Quantitation of plasmalogens chain component isomer and C=C location isomer in bovine heart.
作者进一步对胶质瘤(N=6)和正常(N=6)人脑组织的缩醛磷脂进行了深度分析（Fig. 6）。实验表明，相对于正常人脑组织样本，胶质瘤样本中PE P-34:1、PE P-36:1和PE P-36:2中n-10异构体含量显著增加。此外，基于14组表现出显著变化的异构体，成功实现了对胶质瘤组和正常组的聚类，这在总组成水平上是无法实现的。![]()
Fig. 6. Results of plasmalogens analysis in human brain tissue.
● 总结 ●
在这项研究中，作者开发了一种灵敏的工作流程，通过将离线triFAP衍生化与HILIC-MS/MS相结合，在链组成和C = C位置水平上分析缩醛磷脂。与之前开发的PB-MS/MS方法相比，该工作流程在PE-P和PC-P分析方面表现出更高的灵敏度和简化的工作流程。通过在牛心脏脂质中C = C位置水平鉴定73个PE-P和31个PC-P来展示分析性能。缩醛磷脂的分析显示，与正常人脑组织样本相比，人神经胶质瘤样本中PE P-34:1、PE P-36:1和PE P-36:2中n-10异构体的含量更高。这些发现强调了精细结构分析在研究健康和疾病中脂质代谢的重要性和优势。
编辑：王杰
责任编辑：魏芳
文章引用：https://doi.org/10.1007/s00216-024-05376-9
文章信息：Wang, Y., Xia, Y. Deep profiling of plasmalogens by coupling the Paternò–Büchi derivatization with tandem mass spectrometry. Anal Bioanal Chem (2024).
中国农业科学院油料作物研究所油料品质化学与营养创新团队脂质分析实验室致力于突破脂质组分析所面临的生物基质复杂、脂质及其代谢产物种类繁多且结构复杂、定性和定量分析困难等共性关键技术瓶颈，建立高效，高通量的脂质组分析平台，并将该平台广泛应用于：（1）不同生物种质资源中脂质组成；（2）应用于食品安全与质量控制；（3）脂质的生物功能与营养学评价；（4）开发新的功能脂质。
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
