2023年12月，美国食品和药物监督管理局 (FDA) ，批准Casgevy上市，这是由FDA批准的首款基于CRISPR技术的开创性体外基因编辑疗法，用于治疗12岁及以上伴有复发性血管闭塞危象的镰状细胞病 (SCD) 患者。
Casgevy涉及提取患者的CD34+造血干细胞和祖细胞并运用电穿孔的方法进行体外基因编辑，最后将已经进行基因编辑的CD34+造血干细胞和祖细胞回输人体。体外基因编辑的方式会造成高额的成本，在实际应用中产生限制，因此许多研究人员投身于直接对体内的造血干细胞进行碱基编辑器递送的探究。
2024年11月1日，尧唐生物联合创始人吴宇轩博士、王子君博士和陆钰明博士与华东师范大学合作发表了题为“In vivo genome editing of human hematopoietic stem cells for treatment of blood disorders by mRNA delivery”的研究论文。研究表明，通过研究团队自主开发优化的脂质纳米颗粒 (LNP) 单次或多次静脉注射，能够同时将腺嘌呤碱基编辑器ABE8e的mRNA和γ-珠蛋白基因 (HBG) 的sgRNA高效递送至体内骨髓 (BM) 细胞和造血干细胞 (HSC) ，成功完成HBG靶点的基因编辑，显著激活胎儿血红蛋白 (HbF) 的表达。这一突破展示了基于无抗体偶联LNP的体内基因编辑疗法针对单基因遗传疾病的治疗潜力。
sgRNA的筛选
研究团队首先在HUDEP-2细胞系中筛选合适的sgRNA，发现sgRNA-25和sgRNA-26能够显著诱导HbF的表达。进一步的实验验证了这些sgRNA在原代红细胞前体细胞中的效果，其中sgRNA-25显示出更强的γ-球蛋白表达和有效的碱基编辑。
图1：sgRNA-25在体外细胞实验中展示出强大的HbF表达与γ-球蛋白表达
研究人员进一步将经过基因编辑的HSCs移植到免疫缺陷的NCG-X小鼠模型中，以评估体内基因编辑的效果。结果显示，经过LNP-ABE8e-HBG处理的小鼠，其HSCs中γ-球蛋白表达显著增加，且红细胞的形态和功能得到了改善。
图2：sgRNA-25在小鼠实验中展示出强大的HbF表达与γ-球蛋白表达
LNP的非抗体偶联优化
随后，研究团队在sgRNA-25的基础上开始进行LNP的优化。为了提高LNP的递送效率和特异性，研究人员设计了三个不同的可电离阳离子脂质库，通过改变脂质的头部、连接链和尾部结构，优化了LNP的配方。他们发现LNP-028-ABE8e-PCSK9在体内具有显著的编辑效率，且重复给药后编辑效率进一步提高。
图3：相比其它库中的可电离阳离子脂质，Lipid-028展示出更强的编辑效率
随后，研究团队在Lipid-028的基础上再次进行了脂质头部和尾部的改良，获得了拥有更佳的编辑效率的Lipid-168。Lipid-168的重复给药编辑效率达到Lipid-028的两倍以上。
图4：在Lipid-028基础上优化的Lipid-168
图5：Lipid-168优异的编辑效率与miR-122T的引入对骨髓靶向的特异性提升
此外，通过在ABE8e mRNA的3'-非翻译区引入miR-122T序列，研究人员成功降低了LNP在肝脏中的编辑效率，从而提高了对骨髓细胞的特异性。
优化LNP的体内效果探究
优化后的LNP-168-ABE8e-HBG在小鼠体内的效果非常优异，不仅有极高的基因编辑效率，LNP-168-ABE8e-HBG也不会对β-地中海贫血HSPC产生任何不利影响。此外，这一LNP也不会影响β-地中海贫血HSPC的谱系重建，并且能够帮助红细胞形态的修复。这一实验表明，LNP-168-ABE8e-HBG可在小鼠体内实现高效的碱基编辑，使得足够的γ-珠蛋白能够表达以修复β-地中海贫血的血细胞。
图6.：LNP-168-ABE8e-HBG在小鼠体内的优异效果
本研究中，优化后的LNP-168-ABE8e-HBG可以实现小鼠体内HSC细胞的高效递送与碱基编辑，从而治疗β-地中海贫血。这一研究成果使得使用LNP进行体内基因编辑的道路更为明晰，为此后血液病的in vivo基因治疗打下了坚实的基础。
参考文献：
文中实验数据图片均来自参考文献: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.10.28.620445v1.full-text
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