基于AAV基因治疗大规模生产的挑战

摘要：加快腺相关病毒（AAV）制造的规模扩大对于满足日益增长的基因治疗需求至关重要。然而，AAV基因治疗的生物工艺开发仍然耗时且具有挑战性。质量源于设计（QbD）方法确保生物工艺设计能够满足所需的产品质量和安全特性。快速压力测试、可开发性筛选和小规模技术有潜力在QbD框架内简化AAV产品和制造生物工艺的开发。在这里，我们回顾了它们在抗体制造开发中的成功应用是如何转化为AAV的，但这也将在很大程度上取决于改进的分析方法和工具的适应，因为对AAV成功治疗所需的关键属性有了更多的了解。

亮点

• 腺相关病毒（AAV）是一种安全的基因传递载体，在临床基因治疗中得到了广泛的应用。

• 基于AAV的基因治疗产品由于对其生物学了解有限，以及分析工具和生产工艺不够成熟，正面临制造规模扩大的挑战。

• 压力研究和超小规模试验是两个关键工具，有潜力加速新AAV基基因治疗产品的制造过程开发。

• 当前AAV表征的分析技术面临的挑战包括长时间的等待和随后的不足吞吐量、分辨率、灵敏度、准确性或重复性。这些挑战需要被解决，以实现标准化的产品和过程开发平台。

1. AAV基因治疗的快速出现

先进疗法的快速发展为癌症和罕见疾病治疗提供了新的可能性。其中，基因治疗因其在临床试验中的成功而显示出特别的前景。基因治疗的治疗效果是通过操纵遗传序列或传递遗传物质来实现的，到目前为止，已经开发出针对多种疾病的治疗，包括自身免疫性疾病、神经系统疾病、视网膜疾病和各种类型的癌症。一些基因治疗产品已经获得监管机构的批准，代表着基因治疗发展的重要新里程碑。图1展示了这些获批疗法发展的时间线。

传递遗传物质通常需要将其整合到病毒或非病毒基因转移载体中，如脂质纳米颗粒、腺病毒或AAV。本综述聚焦于AAV（图2A），AAV是细小病毒科的成员，因其广泛的细胞趋向性和低免疫原性而被广泛用于基因治疗和疫苗中。野生型AAV的基因组由三个基因组成：rep、cap和aap（图2B），分别编码关键的病毒复制蛋白、衣壳蛋白（VP1、VP2和VP3）和组装激活蛋白。

迄今为止，在人类（AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6和AAV9）和非人类灵长类动物中已发现超过150种AAV基因型和13种血清型，而在其他物种中也鉴定出更多。它们在细胞趋向性和转导效率上有所不同，导致不同的功能性。

为了使AAV基因组适合临床应用，必须对其进行修改。野生型AAV可以整合到宿主基因组中，造成永久性的、可能遗传的基因修饰，这将给患者带来重大风险。这些风险在用于临床的重组AAV（rAAV）中已被消除，方法是用治疗性感兴趣基因替换rep和cap基因中的一个或两个，并将移除的基因放置在仅在AAV制造期间使用的单独质粒上。因此，新的AAV颗粒仍然具有感染性，但无法将完整的AAV基因组插入到人类宿主染色体中，也无法在野外或注射到人体后复制。

本综述提供了一个概述，介绍了如何使用各种工具，如QbD（见词汇表）、缩小规模、超小规模（USD）和压力测试，来加速AAV生物工艺的开发。我们还总结了当前AAV表征和生物工艺质量控制可用分析工具的挑战。

2. 加速生物工艺开发的工器具

随着临床管线的扩展，对AAV的需求正在迅速增长，这使得建立平台化大规模AAV生产过程的需求变得前所未有的迫切。AAV的制造过程复杂，需要细胞扩增、转染、细胞培养、病毒收获以及多重纯化和缓冲液交换步骤。由于AAV固有的不稳定性、复杂的生物学特性以及相对缺乏能够指导理想产品概况的长期临床数据，AAV制造工艺的开发和规模扩大非常耗时且风险高。AAV的开发还建立在相对较少的先例之上，缺乏在抗体等更成熟平台上发现的AAV特异性生物工艺、细胞系和分析仪器的技术成熟度优势。随着未来的发展增加了单个AAV制造步骤的过程强度，这些挑战将继续演变多年。

预计有几种实验工具能够加速AAV产品配方和早期阶段工艺开发。这些工具在单克隆抗体（mAbs）开发中的成功应用基础上建立，并包括，大致按实施顺序：(i) 产品候选物的可开发性筛选；(ii) 用于快速生物工艺开发的缩小规模和超小规模（USD）工具；以及 (iii) 快速（强制）降解筛选，用于快速制定稳定剂型。每种工具都旨在在其各自的开发阶段使用，以加速可制造产品候选物的选择、优化制造工艺或快速开发稳定剂型，尽管在一个阶段的学习也可以用来通知开发的其他阶段。因此，可以创造效率，例如，通过设计可开发性筛选来生成生物物理数据，更好地通知最终产品配方和保持稳定产品的生物工艺参数操作窗口。mAbs的设计、制造和配方逐渐汇聚在一些稳健的平台方法上。这进一步限制了条件的搜索空间，并导致三个工具使用的许多实验条件有更大的重叠。相比之下，AAV的平台制造方法还没有足够的时间完全发展，因此使用这三个工具测试的条件也在演变。

帮助塑造加速mAb开发的工器具的另一个特点是QbD。这种方法被鼓励用于降低生物制剂制造工艺的开发和规模扩大的风险，通过创建对过程参数如何影响产品属性并最终影响其临床性能的理解。如图3所示，这种方法定义了关键质量属性（CQAs）作为易于测量的生物物理和物理化学产品属性，确保了在质量目标产品概况（QTPP）中定义的所需临床性能；关键材料属性（CMAs）和关键过程参数（CPPs）被识别为如果变化可能会显著影响CQAs的因素。因此，前面定义的三个实验工具有潜力识别CMAs和CPPs，甚至开始量化它们的界限。

图 3. 质量源于设计（QbD）框架的工作流程。缩写：CQA，关键质量属性；CMA，关键材料属性；CPP，关键过程参数；QTPP，质量目标产品概况。

mAbs的平台制造方法和来自许多产品的广泛临床数据意味着它们的CQAs现在可以相对快速地定义。相比之下，随着更多产品产生临床数据，AAV的CQAs可能会继续扩展。这也可能导致使用这里描述的三个工具测试的条件范围和测量的变化。

3. AAV制造生物工艺开发的缩小规模和超小规模（USD）工具

缩小规模平台使用与中试至大规模制造相同的工艺单元操作，并且具有足够严格的控制以实现高再现性，但操作体积要小得多，通常可以并行运行，以快速探索和优化工艺变量。

早期中试规模的制造工艺优化强烈指导了CMAs和CPPs的可接受设计空间，以及维持它们在设计空间中的潜在控制策略。因此，缩小规模平台可以将此扩展到对生物工艺操作参数的更广泛探索，从而获得更深入的理解。

这种方法现在已为mAb生物工艺开发确立，并可以轻松地转移到AAV，尽管这些产品之间存在显著差异。例如，微型生物反应器如ambrTM（由Sartorius开发）可以提供与大型生物反应器中观察到的可比的细胞培养性能、环境控制性能和抗体生产力，使它们适合作为大规模细胞培养/发酵的预测工具。已经使用24深方孔板的缩小规模方法优化了悬浮培养中慢病毒载体的生产，因此有很好的潜力在AAV生产中同样成功。

其他强大的缩小规模系统，如微型色谱柱和微升批量孵育，也被广泛用作色谱条件和树脂选择的高通量筛选方法。这些缩小规模平台已为抗体确立，并正在适应以加速AAV生物工艺开发。当然，AAV的具体筛选条件将有所不同，甚至可能在血清型之间，适应已知的AAV阴离子交换色谱的CPPs，如洗脱电导率和pH，这些影响空-满衣壳分离性能。

与缩小规模不同，USD工具不复制小规模运行的过程，而是设计为仅使用少量样品（毫升级）精确模拟大规模工艺单元操作中遇到的关键条件和暴露。它们可以用来优化产品、溶液条件或生物工艺参数，并为每个单元操作定义CPP设计空间。特别是，它们可以提供CPPs对产品CQAs影响的原因和效果理解，这对于QbD框架至关重要。

填充/完成和超滤/透析（UF/DF）步骤通常被发现是功能性AAV滴度损失的主要原因，因此USD可能被用来识别这些损失的原因。这些损失被提出来自于浓缩步骤中剪切诱导的病毒聚集。然而，尽管UF/DF和填充/完成是生物工艺中剪切应力的两个主要来源，与泵和阀门中的微腔化一起，需要进一步调查以确认剪切应力是AAV损失的主要原因。对于治疗蛋白来说，情况就是这样，其中聚集归因于剪切应力，不仅单独，而且与在色谱纯化步骤中暴露于空气-液体界面或吸附到固体表面，或由于泵和阀门中的高剪切速率而产生的空化。此外，溶液的pH值和固体-液体界面中固体表面的粗糙度被发现影响剪切应力下蛋白质聚集的程度。

最近的一项USD研究描述了蛋白质浓度、剪切率和跨膜压力对UF/DF期间渗透通量和mAb聚集的影响。与中试规模过滤实验的比较显示，测试条件与渗透通量之间的相关性相似。发现增加的过滤时间和产品浓度与USD和中试规模UF/DF模型中的浊度增加相关，表明增加的蛋白质浓度导致更频繁的蛋白质碰撞，更高的聚集倾向，因此浊度更大。尽管两个模型中的渗透通量有很好的一致性，但两个模型之间剪切暴露程度的差异导致了浊度检测上的轻微不一致。因此，需要进一步修改，以使USD更准确地模拟UF/DF中剪切应力的影响。

在另一项研究中，USD模型准确地预测了离心过程中质粒DNA的剪切应力影响。

迄今为止，USD模型已成功模拟了包括质粒DNA、mAbs、腺病毒和细胞在内的多种生物制剂的大规模生物工艺条件。然而，尚无文献报道USD模型预测剪切应力下AAV的行为。

4. 可开发性和强制降解筛选

压力测试在确定产品在工艺、储存、运输和使用条件下的稳定性方面发挥着重要作用，并且对于mAbs等平台生物制剂已得到确立。它们在产品配方优化期间实施，但也在早期产品候选物筛选中作为整体可开发性平台的一部分，其中还包括几种生物物理特性测量。

对于可开发性筛选，压力测试旨在确定产品是否在通常用于制造的条件和时间尺度（小时到天）下保持稳定和可溶。这也为产品配方的控制措施和潜在条件提供了初步的范围界定，生物物理数据可以通知生物工艺开发期间CPPs和CMAs的设计空间。

可开发性筛选越来越多地包括更极端（加速或强制降解）的条件，旨在筛选出可能难以制定成在几个月到几年内保持稳定的产品的候选物，使用典型缓冲液和理想的蛋白质浓度。因此，这与配方开发和优化中使用的加速降解应力条件重叠。

加速降解通过提高温度、搅拌或光照暴露，使产品配方和最终剂型中的降解途径在比预期产品保质期短得多的时间尺度上被研究。这使得它们非常适合快速配方开发，通过筛选最适合的辅料来稳定产品，然后进行优化。例如，现在常用的治疗蛋白辅料海藻糖的稳定效果就是通过热休克（热应力）测试发现的。

压力测试对生物制剂应用适度（用于制造可开发性）或极端（用于配方开发）的条件，可以分为物理压力（例如，温度、光照、机械剪切、表面吸附）和化学压力（例如，pH值、变性剂、氧化、还原）。虽然用于监管文件的加速稳定性和光照暴露条件受到国际协调委员会（ICH）指南的高度规范，如ICH Q1A和ICH Q1B，但在开发期间使用的强制降解条件通常更加多变，特别是对于具有与一般药品产品不同属性的生物产品。生物产品的应力条件“应逐案选择”（ICH Q5C）。这允许根据不同的目的选择不同的强制降解条件，无论是用于配方开发、产品可开发性筛选还是模拟生物工艺压力。

5. mAbs和AAV的压力测试比较

经过多年的实验，用于mAbs开发的压力测试已通过行业共识在已建立的产品和制造平台上变得相对标准化。然而，mAb的压力条件并不能简单地转化为AAV产品，因此仍需要研究和改进。报道的AAV压力条件差异显著，导致不同的结果，但也取决于具有不同生物物理特性的多种AAV血清型。一套标准化的压力测试，可能针对某些血清型进行调整，将有助于AAV产品基于平台的工艺和配方开发。

值得考虑的是，AAV的压力测试开发是否可以从之前为mAbs开发的测试中学习。表1显示了之前报道的AAV和mAbs的压力测试示例，揭示了AAV和mAbs探索条件的广泛变异性以及一些相似之处。

表 1. 文献中报道的AAV和mAbs的示例压力测试及与一些ICH指南加速稳定性研究条件的比较

在4°C下储存数周为这两种生物制剂的大多数热应力测试提供了对照条件。这符合AAV和mAbs长期储存目标，即在4°C下稳定1-2年，考虑到全球运输和储存设施中4-8°C的冷链可用性。

提高的热应力在mAbs配方开发和监管文件中广泛建立用于加速降解。大多数mAbs的热熔显示，它们的第一个热转变通常在45-50°C以上。因此，为了专注于从天然蛋白质中降解（主要是聚集）的动力学，加速降解通常不超过40-50°C，以避免蛋白质的全局展开。ICH指南也不超过这个温度。然而，一些研究使用了更高的温度，可能是为了区分特别稳定的配方。

相比之下，AAV的热熔点因血清型而异，从66.5°C到89.5°C不等。然而，报道的AAV加速热降解测试通常偏向于快速高温热休克，如65-80°C持续15-30分钟。这些似乎专注于引起部分衣壳变性和DNA释放，通常用于比较AAV变体的热稳定性。然而，这种极端条件并不代表用于配方或生物加工条件的加速稳定性测试。此外，这种极端压力可能不是长期在较低储存温度下稳定性的良好预测，正如在比较mAbs的高温和低温聚集动力学时发现的问题。

极端pH值孵育也已确立为mAb可开发性筛选的标准，通常与热应力结合使用。在pH 3-4下对mAbs进行孵育，评估它们在pH 5以下更快速地变性和聚集的倾向，但也评估它们在亲和色谱洗脱和病毒灭活步骤中使用的低pH值下的存活能力。在pH 8.5-10下进行孵育也通常评估在离子交换色谱中使用的高pH条件下mAbs对去酰胺化和聚集的敏感性。相比之下，对于AAV，报道的筛选评估了pH 4-7.5的范围。这反映了当前对AAV损失的焦点，这些损失最有可能源于在标准生物工艺或配方pH条件下的聚集形成和表面吸附，因此在这些条件下早期评估稳定性对于设计和优化生物工艺是有用的。

目前，去酰胺化并不被广泛视为AAV的关键质量属性（CQA），这解释了缺乏高pH值测试的原因，尽管已有报道AAV的去酰胺化会改变载体功能。与此同时，AAV的纯化通常使用亲和捕获色谱，洗脱在低pH值下进行。低pH值是否会导致制造中的新挑战，特别是在过程强度增加以获得更高的病毒滴度时，还有待观察。

冷冻-融化代表了AAV和mAbs都面临的制造挑战。药物物质材料通常在初次制造后被冷冻，以避免在填充和完成操作前的长时间存放，特别是当这需要运输到不同的地点时。过程调度挑战也可能导致存放时间的广泛变异性，因此最好通过冷冻材料来避免。因此，冷冻-融化压力测试对于评估AAV或mAbs在冷冻-融化耐受性方面的可开发性是有用的。报道的mAbs和AAV的冷冻-融化测试都使用-80°C和25°C的冷冻和融化温度，以及五到十二个周期，反映了在制造中使用的相当标准化的冷冻-融化过程。

氧化剂或还原剂如H2O2和DTT已被用于加速抗体的氧化或还原反应。然而，没有找到用于筛选AAV的例子，可能反映了目前这些反应在CQA列表中的缺失，理由是迄今为止缺乏临床证据。对于mAbs的氧化和还原筛选，报道的条件有广泛的变异性，氧化在0.05-3% H2O2或过氧乙酸中进行，还原使用高达500 mM DTT。氧化或还原最终是否会成为AAV产品的CQA，需要适当的压力测试，还有待观察。

基于搅拌的机械应力测试在稳定mAb配方的开发中已确立，并模拟了产品在小瓶或预充填注射器中运输期间的机械剪切应力。同样，使用USD技术在离心、泵和过滤工艺中发现的条件下绘制mAbs的剪切敏感性也已确立。AAV制造的挑战揭示了特别难以最小化的AAV损失的特定步骤，但迄今为止，对于表面吸附、自相互作用和机械剪切在这些产品损失中的相对作用，还没有进行多少区分。因此，USD方法和加速降解研究，类似于那些用于mAbs的，对于更详细地理解这些机制具有重要的潜力，并最终定义一个合适的可开发性筛选。

最后，光应力有一个标准测试，根据ICH Q1B指南应用于产品配方。这个测试是为了确定药物产品在运输过程中暴露于紫外线时是否会经历变化。光应力测试是一个极端测试，因为制造和包装材料中的存储期间可能的暴露量很低。然而，可能会发现在较低暴露水平的光是影响产品质量的重要特征。这是mAbs由于质谱（MS）的更广泛采用而继续出现更多细节的领域。对AAV的类似分析最终可能会揭示值得关注的降解过程，但目前除了根据ICH Q1B指南进行的现有最终产品测试外，并没有明显的需要进行基于光的可开发性筛选。

总的来说，与抗体相比，为AAV开发的应力条件的相对缺乏反映了mAb制造业的成熟度要高得多，那里已经为更多的mAb产品和候选物开发了关键质量属性（CQAs）。然而，mAbs的CQA列表是随着时间的推移逐渐增加的，随着管线的扩展和生物工艺向更高过程强度的演进，预计AAV也会呈现类似的趋势。由于mAbs在过去近50年中已经被广泛地发展到更高的强度，可能有许多标准和技术可以适应AAV。目前AAV产品的制造过程已经使用了从mAb生物加工中主要适应的单元操作（图4）。随着这些过程对AAV的进一步演进，将需要更多的考虑，以使可开发性和USD应力条件更适合模拟AAV所经历的过程应力。

即使以mAbs的广泛知识和经验作为参考，但迄今为止，为AAV建立共识或标准应力条件集的工作做得相对较少，也测试了将mAb应力条件转移到AAV的可转移性。这在一定程度上受到缺乏适当分析技术来监测许多AAV降解过程、对未来产品可能的AAV CQAs理解不完整，甚至对标准AAV样品材料的获取不足的阻碍。

6. 大规模AAV制造的分析方法开发当前挑战

作为在生产过程中监控产品关键质量属性（CQAs）的工具，分析方法极为重要。分析能力的演进将使可开发性得到改善并加速压力测试，因此在这里我们简要总结当前的分析方法及其挑战。

在AAV生产过程中，监控其CQAs，如效力、身份、纯度和病毒的稳定性，以确保临床应用中的产品的安全性和有效性。这些质量属性中的每一个都归因于不同的特性，如感染性滴度、病毒基因组滴度、基因组身份、衣壳化学计量比或聚集。这些属性的任何变化都可能削弱产品的效力或导致严重的安全问题。例如，在AAV的制造过程中很难去除空病毒衣壳。由于它们缺乏治疗性基因组，它们不会直接产生治疗效果，但可能会触发针对AAV病毒衣壳的免疫反应。然而，空衣壳可能通过充当诱饵来中和对AAV的预先存在的免疫反应，从而在实现整体治疗效果方面发挥作用。显然，一致的空衣壳与全衣壳的比例是一个重要的CQA。

当前用于AAV表征和监控的分析方法大多是为较小的生物制剂设计和优化的，导致对AAV存在各种不足。由于AAV的分子量大、寡聚体复杂性、蛋白质与单链DNA的混合以及与生物加工过程中典型的mAb浓度相比病毒颗粒的低浓度，现有分析方法适应AAV产品尤其具有挑战性。表2中对AAV使用的分析方法及其各自挑战的总结表明，改进空间仍很大。尽管目前的技术水平足以分析生产过程中的AAV CQAs，但它们并不总是非常准确，常常耗时，并且不能用于实时监控。因此，几乎所有AAV CQAs都需要更强大的分析方法，具有更高的吞吐量、更大的灵敏度和动态范围，以及理想情况下能够实时监控产品CQAs。

表 2. 用于AAV质量控制的当前分析方法示例

质谱（MS）已成为mAb生产中宿主细胞蛋白（HCPs）定量和鉴定的强大技术，以及包括糖基化变异性、氧化、去酰胺化、化学加合物形成、片段化和C末端剪切在内的许多其他mAb属性。最近对腺病毒异质性的MS分析将关键的结构组成变化与感染力联系起来，从而展示了如何将一些分析方法从mAbs有用地转移到基因治疗产品。

最近的一项研究介绍了一种类似QbD方法的方法来帮助开发强大的分析方法。然而，这种方法不是确定期望的产品质量，而是从确定分析目标开始，然后是一系列的筛选、评估和改进程序，以产生最优的分析方法。使用评分系统根据它们在可操作性和性能方面的限制对不同的分析方法进行排名。得分最高的分析技术将进行改进和进一步评估。这项研究中的一个例子验证了该方法在开发腺病毒分析方面的可行性，表明它也适用于AAV。

未解决的问题

• 随着基于AAV的基因治疗产品变得更加普及，可能会出现哪些额外的关键质量属性（CQAs）？

• 研究将需要集中在确保有适当的分析方法可用并经过验证。

• 我们对AAV在生物工艺中以及配方产品的不稳定性有多了解？进一步的研究应该更详细地绘制AAV的降解途径，并评估影响这些途径的因素。

• 当生物工艺的进步增加了AAV制造的过程强度时，这将如何影响AAV的降解途径和过程中的稳定性？

• 加速降解测试和超小规模（USD）设备的开发需要跟上任何新出现的关键不稳定性。

7. 结论

AAV是基因治疗的安全和有前途的候选者，近年来经历了快速增长。然而，由于缺乏商业化的例子作为先例和缺乏健全的行业标准，生物工艺开发目前耗时且风险水平高。随着越来越多的AAV介导的基因治疗从临床转向商业化，监管指南将继续演进，可能会增加分析负担（见未解决的问题）。此外，技术创新将增加AAV制造过程的强度和可扩展性，对分析方法提出新的物理要求。

根据其他生物制剂的先例，这可能通过进一步的培养基优化以及改进的过程监控和控制来实现。下游处理对AAV来说也仍在演进，并代表着一个重大的技术挑战。AAV的一种广泛使用的实验室规模纯化技术是在铯氯化物（CsCl）或碘克沙醇梯度上的超速离心，这可以很好地分离全病毒衣壳和空病毒衣壳，但不具可扩展性。色谱法在商业上是可扩展的，因此人们已经做出了巨大努力来生产适合特定AAV血清型的亲和柱。还有一种强烈的兴趣在于阴离子和阳离子交换色谱法作为一种低成本选择，这也避免了亲和色谱法中使用的低pH条件。

在这个不断演进的领域中，可开发性筛选和缩小规模以及加速稳定性测试的应用可以通知QbD，以确保AAV生物工艺的稳健可扩展性。然而，过程开发挑战仍在阻碍建立一个健全的大规模AAV生产平台。为了应对这些挑战，将需要建立经过验证的标准、分析方法、产品CQAs和适当的可开发性筛选。由于其复杂性，AAV产品的标准化可能是具有挑战性的，但这将是必要的，以减轻对基因治疗产品预期增加的监管负担。为了实现这一点，应该努力更好地理解哪些是基本的产品CQAs，并预测随着我们对临床产品了解更多，哪些其他潜在的CQAs可能会出现。分析方法也应该进一步改进，以实现对更小样本的更快分析，因为从“潜在”到“实际”CQAs的逐步转变将带来更大的分析负担。在不久的将来，预计AAV生产和供应商开发的分析方法将更多地定制到AAV生物学。与此同时，可能会更多地关注连续和一次性生物工艺，遵循mAb生物加工的演进模式。

随着技术的进步，其他策略出现以协助mAbs的生物工艺开发也可能适应于AAV。特别是，计算机辅助生物工艺设计、数据挖掘、过程控制和生物工艺设备设计正成为mAb平台的主要趋势，这些趋势也可以早期采用于AAV。与已经建立的mAbs相比，AAV的开发仍在迈出第一步，但通过尽可能从mAbs中学习，AAV制造的成熟之路应该会更短。

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