脓毒症的病理生理学和基于精确医学的免疫治疗

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译：潘尚文 王睿 医师

      脓毒症可由多种微生物引发。在ICU收治的脓毒症患者中，大约三分之二的患者可以确定有致病微生物^10,14,15，其中肺部和腹部是最常见的感染部位^{1,14,16 - 18}。目前对脓毒症的定义是“宿主对感染的反应失调”，是威胁生命的器官功能障碍的驱动力¹ 。虽然感染开始时的宿主反应对于根除入侵的病原体是必要的，但其在脓毒症中的调节失调可能对宿主有害，轻则伴有严重炎症的周围器官潜在损害，重则继发感染易感性增加相关的严重免疫抑制(图1)。值得注意的是，有关脓毒症患者免疫反应的知识几乎完全来自入院时进行的研究；关于脓毒症患者入院前后宿主反应的时间进程和特征的信息很少。

      脓毒症中丰富的炎症反应主要由补体和凝血系统、白细胞、内皮细胞和免疫细胞释放的细胞因子(包括趋化因子和干扰素)介导¹⁹。促炎症细胞因子的不受限制激活，如肿瘤坏死因子和白细胞介素1β(IL-1β)，在组织损伤中起主要作用，激活的中性粒细胞通过释放活性氧、蛋白酶和中性粒细胞胞外陷阱而进一步增强，这些胞外陷阱由含有蛋白酶、组蛋白和DNA的纤维网络组成，可导致组织损伤²⁰。补体系统的激活与C3a和C5a的释放有关，C3a和C5a是强大的促炎分子，可以招募和激活免疫细胞和血小板，增加血管通透性，并刺激白细胞的黏附和移动²¹。脓毒症的凝血系统随后的失调的特征是不受控制的促凝血活性，同时内源性抗凝机制(即抗凝血酶、组织因子途径抑制物和蛋白C系统)的损害，后者主要是由于炎症诱导的对位于血管内皮细胞表面的糖蛋白-多糖层-糖萼的损²²。

      在平衡的免疫反应中，抗炎机制被启动，以调节炎症并防止周围、组织损伤。然而，在脓毒症中，抗炎反应可能会变得过于激烈或过于持久，并导致严重的免疫抑制^23，24。免疫细胞的功能受其能量状态的支配²⁵。在静息状态下，免疫细胞主要利用三羧酸循环和氧化磷酸化(OXPHOS)。当免疫细胞被大多数病原体激活时，糖酵解(葡萄糖分解为丙酮酸和乳酸)被强烈激活以产生能量，而三羧酸循环(Krebs循环)用于合成脂质。与OXPHOS相比，糖酵解产生ATP的效率较低，但速度要快得多。脓毒症患者的外周血单核细胞表现出广泛的代谢缺陷，表现为ATP和NAD+含量降低，乳酸产生减少，氧气消耗减少，这种情况被称为免疫代谢麻痹²⁶。此外，脓毒症相关免疫抑制的特点是：抗炎细胞因子浓度升高；CD4+和CD8+T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞耗尽和凋亡；T细胞耗竭；抗原提呈细胞重新编程，在刺激下产生促炎细胞因子的能力降低；细胞表面分子表达增加，如程序性细胞死亡1(PD-1)；以及HLA-DR表达减少^23，24。

      脓毒症中单核细胞的重新编程在很大程度上是由表观遗传学变化调节的，包括转录因子表达、使用和结合动力学的变化、组蛋白修饰和DNA甲基化变化²⁷。表观遗传学变化也与一些脓毒症患者存在的长期免疫抑制状态有关。调节性T细胞和髓系来源抑制样细胞数量的相对增加进一步促进了免疫抑制²³。单细胞RNA测序揭示了败血症患者中CD 14+单核细胞状态（称为MS 1），其功能很可能相当于单核骨髓源性抑制样细胞²⁸。近年来，在脓毒症相关免疫抑制，特别是PD-1和PD-L1的背景下，节点调节剂受到了极大的关注。T细胞、单核细胞和粒细胞上PD-1表达的延长和抗原提呈细胞上PD-L1表达的增强被认为是免疫抑制的标志。细胞效应功能受损与脓毒症患者对继发性机会性感染和潜伏病毒重新激活的易感性增加有关²³。免疫反应失调可能会产生严重后果，包括引发凝血障碍：多达三分之一的脓毒症患者出现弥散性血管内凝血(DIC)，其特征是血小板计数低，纤维蛋白降解产物或可溶性纤维蛋白水平高，凝血时间延长，内源性抗凝血剂(如抗凝血酶和蛋白C)含量低。严重的DIC会导致中小血管形成血栓和大量出血，这与死亡风险增加有关。目前，对DIC尚无特效治疗方法^15、22、30。

      严重的器官功能障碍是免疫反应失调的另一个重要后果。脓毒症引起的器官衰竭通常影响呼吸和心血管系统，以及中枢神经系统、肾脏、血液系统和肝脏系统^15，31-33。目前存在不同的器官功能障碍表型，它们的识别将是重新定义脓毒症及其对器官预后的关键，包括与脓毒症的发病时间和治疗时间关联。脓毒症的呼吸衰竭通常表现为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，其特征是突然出现弥漫性肺泡上皮损伤、非心源性肺水肿、血氧水平下降和需要机械通气^34，35。此外，炎症细胞，如中性粒细胞和单核细胞，聚集在肺泡和肺微血管中。与脓毒症类似，ARDS是一种复杂且高度可变的综合征，根据临床和生物学特征可分为不同的表型^35，36。每个亚型都可能受益于与失调过程相关的特定治疗^35，36。脓毒症的心血管功能障碍，以心肌功能障碍及相对(由血管扩张引起)和绝对(由血管通透性增加引起)低血容量为特征³⁷，被认为是由钙稳态、线粒体功能障碍、细胞凋亡、循环心脏抑制介质和一氧化氮的改变触发的^15，38。脓毒症相关性急性肾损伤(AKI)也是多种病理生理机制的结果，包括炎症级联反应及其后果，如补体激活、线粒体功能障碍、代谢重新编程、低血压、肾素-血管紧张素-醛固酮系统失调、微循环障碍和大循环异常，以及肾毒性药物的使用^{39 -41}。在一项涉及大量患者的综合研究中，确定了四种在年龄、临床表现、并发症和死亡率方面不同的临床表型⁴²。

      总体而言，器官功能障碍的发生可能是与感染或宿主对感染的反应有关的直接机制的结果，也可能是由脓毒症或脓毒症治疗的有害的后遗症驱动的间接机制的结果。总而言之，它们代表了独立的临床表型。更好地了解潜在的分子途径和对这些不同临床表型的认识将有助于在未来的试验中丰富和更好地分层队列，并有望增加为脓毒症患者亚组发现有效的新治疗靶点的机会，类似于肿瘤学的标准护理。

      目前sepsis-3对脓毒症的定义是感染相关的失控宿主反应，导致器官功能障碍，这反映在序贯器官衰竭评估(SOFA)评分的增加上，作为与后续死亡相关的器官功能障碍的有效测量¹。这取代了以前的sepsis-2标准，后者侧重于疑似或确诊感染的人的全身炎症反应综合征(SIRS)^5，43，44。许多研究表明，大约80%-90%的脓毒症患者同时符合脓毒症-2和脓毒症-3标准，两组观察到的死亡率相似^43，45。然而，其他研究表明，新旧败血症标准之间的一致性很差，使用两套标准的脓毒症诊断重叠在50%到60%之间^46，47。这些差异突出了一个重要的特征：有些人根据败血症-2标准患有败血症，但根据败血症-3标准不再被认为患有败血症，但仍可能有较差的临床⁴⁸。将生物标记物与败血症-3标准相结合，已被建议作为一种策略，以改进当前标准的性能，以实现更准确的诊断。潜在的生物标志物候选有乳酸⁴⁹、前列环素(一种可溶的CD14亚型)⁵⁰、动脉PH和可溶尿激酶型纤溶酶原激活物受体(suPAR)⁵²。

      尽管在确定脓毒症的最佳定义方面存在挑战，在过去的100年里，对于感染性疾病患者，特别是脓毒症患者的治疗和结局有了显著改善^{53 -55}。这可直接归因于感染治疗方面的几次革命性进展。抗生素的发现首次使治疗感染的病因成为可能，微生物学工具(例如先进的培养方法以及分子和免疫学测试)大大改善了病原体的检测，可更有针对性地使用抗菌剂，直接杀死致病微生物或防止其复制。此外，现代重症监护医学的发展可在感染的最关键阶段对器官功能障碍进行支持。尽管取得了这一进展，但一部分人，特别是那些具有明确风险的人(如年龄较大或已有器官功能障碍或充血性心力衰竭)，仍然面临高死亡率的风险；即使他们存活了下来，许多人在离开医院时也会留下后遗症，如身体、精神或认知功能障碍^56、57，这会极大地影响他们的生活⁵⁸。故我们迫切需要对这些并发症进行治疗。

      目前的脓毒症治疗主要基于两大支柱：早期适当的抗菌治疗(在必要时进行源头控制)和器官支持，这在过去的一个世纪中大大降低了脓毒症的死亡率。不幸的是，在过去10年里脓毒症的死亡率一直保持稳定⁹。早期目标导向治疗最初被认为可以改善脓毒症的预后⁵⁹，但随后的研究未能证实这种方法^{60 -62}。据研究，与脓毒症相关的高死亡率主要是由于缺乏能够支持和逆转失调宿主免疫机制的治疗方法。因此，假设使用免疫治疗方法靶向治疗失调的宿主反应有可能成为脓毒症治疗的第三大支柱。

      然而，在大多数研究脓毒症免疫疗法的试验中，参与者是采用“一刀切”的方法招募患者的。缺乏成功的治疗脓毒症的免疫疗法，其最重要的潜在原因可能是研究的统计能力不足，无法显示临床相关的益处，并且缺乏对脓毒症患者的合理分组，从而忽略了宿主反应的广谱性。一些患者的特点是严重的高炎症，可以从抗炎治疗中获益，但另一些患者出现免疫抑制，应该使用免疫刺激剂治疗(图2)。是否存在其他更复杂的免疫反应偏差的脓毒症内型尚未得到详细研究确定。生物标志物可能有助于选择最适合特定免疫治疗策略的候选者。生物标记物，如单核细胞上的绝对淋巴细胞计数和HLA-DR表达，已用于选择合适的个体接受重组糖基化人IL-7、重组干扰素-γ（rIFNγ）、重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子或抗PD-1抗体。补充表1总结了采用“一刀切”方法进行的随机对照试验^{63 -73}和少数采用生物标志物指南进行的随机对照试验^{74 -81}。

    最近发表的临床试验(ClinicalTrials.gov识别号:NCT03332225)首次提供了基于精确医学的免疫疗法治疗脓毒症的有益效果的证据80。根据血清铁蛋白浓度和循环CD14+单核细胞上HLA-DR的表达，将符合诊断标准的脓毒症患者被分为三组，代表三种主要的免疫类型:巨噬细胞活化样综合征(MALS)(高血清铁蛋白)(约占参与者的10%)；脓毒症引起的免疫麻痹(CD14+单核细胞上HLA-DR受体低)(约30%的参与者)；还有一种中间状态即两个条件都不满足。基于这些标准的治疗可致43%的IL- 1Ra治疗的MALS参与者的SOFA评分下降，而安慰剂治疗的参与者为10%。没有足够多的免疫麻痹患者接受治疗，因此无法得出这一方面的结论80。一项正在进行的随访试验(ImmunoSep, ClinicalTrials.gov识别号:NCT04990232)在双盲设计中使用脓毒症-3标准分层，分为接受IL-1Ra或IFN-γ治疗的组⁸¹。

      一项对COVID-19(一种病毒性感染)患者的免疫治疗进行评估的研究，为在严重急性感染(如脓毒症)中采用精准医学方法进行免疫治疗提供了一个强有力的论据⁸²。地塞米松和抗IL -6治疗仅在病情较严重和炎症加重的患者亚组中有效，这是由c反应蛋白浓度决定的^83，84。SAVE和SAVE- more试验提供了更有力的论据，在试验中，需要氧气的COVID-19肺炎患者随机接受安慰剂或重组IL-1Ra (阿那白滞素)的标准治疗，但前提是他们满足可溶性尿激酶纤溶酶原激活剂受体(suPAR)血浓度为6 ng/ml或更高的诊断标准，这是早期IL-1激活的生物标志物⁸⁵。结果显示，阿那白滞素组28天后预后较安慰剂组差异的几率为0.36(95%可信区间，0.26-0.50;P < 0.0001)⁸⁶，以致阿那白滞素被欧洲药品管理局和美国食品和药物管理局批准作为COVID-19的治疗药物。在COVID-19大流行期间从免疫治疗的精准医学方法中吸取的经验教训，现可应用于一般的脓毒症。

      图1|脓毒症中的免疫反应。脓毒症中的免疫调节失调可以从具有潜在器官损伤的过度炎症到与二次感染易感性的增加。

      图2|脓毒症中的免疫亚型。脓毒症患者的基于免疫的治疗方法应该个性化：以导致严重炎症的免疫亚型为特征的个体可以从免疫调节治疗中受益，而那些具有免疫抑制的个体则应该使用免疫刺激剂治疗。此类治疗应根据每个个体特征的特定免疫亚型开始。

      脓毒症患者免疫疗法治疗效果未得到证实的可能原因之一是，治疗未能针对脓毒症中存在的广泛异质性进行调整，例如就致病病原体（如革兰阳性或革兰阴性细菌，病毒或真菌）、起源器官（如肺部、尿道或腹部）和免疫特征（从过度发炎到免疫瘫痪）方面而言。因此，预期单一药物能够在疾病的全谱范围内对失调的免疫反应进行反调节是不现实的。一种药物对一个人有效，可能会加重其他人的疾病，例如当免疫麻痹患者接受免疫抑制药物治疗时，或者当免疫过度反应患者接受免疫刺激药物治疗时。

      目前“Sepsis-3”定义将脓毒症（伴有器官功能障碍和免疫失调的感染）与无器官功能障碍的感染区分开来，但它未能阐明这种综合症的异质性和潜在病理生理，阻碍了分子靶向药物的发展和应用。脓毒症患者可能表现出免疫过度反应或免疫瘫痪，但也可能有不同的分子原因导致某种特定的免疫类型。例如，在一些人中，过度发炎可能由IL-1或IL-6途径激活介导，而在其他人中可能由过度激活的补体途径导致。因此，建议将脓毒症患者进行分子和/或临床分层，将具有相似病理生理的患者分成亚组，将会提高针对特定免疫调节机制的疗法的效果。

      精准医学是一种疾病治疗方法，它根据临床和生物学标准以及生物标志物（包括免疫、实验室、高分辨率成像和基于组学的测量）对患者进行分层，以便允许采取更精确预防、诊断和治疗策略的模式，从而照顾到个体的医疗和健康特征。新的复杂统计分析方法，包括机器学习和人工智能算法，是实现这一目标的重要工具。基于精准医学的方法在提高脓毒症免疫治疗效果方面具有巨大潜力。然而，尽管人们越来越一致认为，只有通过分层和精准医学方法才能提高脓毒症免疫治疗的疗效和结果，但挑战在于定义脓毒症患者的亚组以及个体内疾病的动态变化，并将患者与最有前景的免疫疗法相匹配。

      在脓毒症中识别免疫表型的一个有前景的方法是通过免疫学检测来区分那些表现出过度炎症反应或免疫麻痹的脓毒症患者。这些表型被定义为“高炎症反应型”或“低炎症反应型”，它们对治疗的反应往往不同。已经提出了几种循环生物标志物来识别脓毒症中的高炎症反应，包括C反应蛋白（CRP）、铁蛋白、白细胞介素-6（IL-6）和可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体（suPAR），并且提出了MALS（巨噬细胞活化综合征样疾病）这一术语来描述这种炎症性脓毒症内型。在与此相反，患有淋巴细胞减少、细胞因子产生能力缺陷以及单核细胞HLA-DR表达低的患者被描述为具有免疫麻痹脓毒症亚型。针对这些亚型，已经提出了特定的治疗方法，主要是用于MALS的抗IL-1治疗（如重组IL-1Ra/阿纳金林）和用于免疫麻痹的rIFNγ、IL-12、白细胞介素、重组IL-7和检查点抑制剂。最近，一些使用这种分层和治疗方法的相对较小规模的2期随机试验已经完成，其他试验也在进行中。

      尽管目前分层研究主要依赖于免疫学检测，但基于高维组学技术的引入为临床和转化脓毒症研究开辟了新机遇。目前，最常用的方法是循环免疫细胞的转录组学，该方法已在社区获得性肺炎和脓毒症患者中识别出脓毒症反应特征（SRS1和SRS2）。SRS1内型与免疫抑制和更高的死亡率相关。一项大型流行病学脓毒症研究提出了四种脓毒症转录组内表型，称为Mars1-Mars4。Mars1在不同队列中与免疫缺陷和更高的死亡率相关，而Mars3内型的患者则免疫失调较少，死亡率风险相对较低。另一项基于全血转录组的研究提出了三种内表型：“炎症性”（高炎症和死亡率）、“适应性”（高适应性免疫激活和较低死亡率）和“凝血病性”（血小板脱颗粒和凝血功能障碍，主要见于老年人和死亡率较高者）。最近的研究则提出了五种内表型，分别是“中性粒细胞抑制性”（与中性粒细胞活化和免疫抑制相关）、“炎症性”（促炎反应增加）、“先天宿主防御性”（白介素信号传导）、“干扰素性”（IFNα、IFNβ和IFNγ增加）和“适应性”（适应性免疫增加）。

      综上所述，尽管有明确的证据表明，基于全血的转录组等高维数据空间可以定义脓毒症的内表型，但这些发现对于临床应用的有效性仍需要进一步的研究来阐释。这主要是因为不同研究所得结果的异质性，需要进一步解释这些差异，并最终形成一个关于脓毒症内表型的共识模型。这样的共识模型不仅可以更好地从生物学和功能上解释脓毒症，还可以有助于改变患者的诊断和治疗选择。

      尽管十多年来，高维数据在脓毒症研究中已有诸多应用，但要从这些应用中为患者带来临床益处仍然面临挑战。这主要归咎于研究与临床实践之间的难题，其中涉及多个因素。

      首先，基于组学的诊断方法往往复杂且难以在常规临床环境中实施。对于脓毒症这种严重的急性疾病而言，这一问题尤为突出，因为很难在少数设备完善的中心集中进行诊断和治疗。

      其次，临床上使用的表型与研究得出的内型之间的重叠程度尚不清楚，这使得后者难以融入既定的临床指南。第三，在临床环境中，时间和资源往往有限，难以应对嵌入新概念所需的复杂性和研究需求，而这些对于包括高维数据应用在内的精准医疗至关重要。第四，这类方法往往导致诊断成本上升，这在现有医疗体系的经济承受范围内往往难以负担。

      为了克服这些障碍，我们提出了一个迭代过程，将基于数据的内型（endotypes）引入临床实践（如图3所示）。当前的临床表型主要依据临床参数、影像学方法及临床实验室检查来定义，但我们将在此基础上进一步整合微生物学结果和基于免疫学参数的内型。这些免疫学参数通过相对简便的实验室流程即可获得，包括但不限于免疫生物标志物检测、微生物病原体的分子诊断以及流式细胞术分析。我们将采取动态评估策略，持续监测这些参数在疾病进程中的变化。在脓毒症的所有临床试验中，我们都将纳入免疫学检测，如生物标志物和细胞因子检测，以及免疫细胞群体的流式细胞术分析，并将这些检测结果与基于组学（蛋白质组学、转录组学、代谢组学等）技术得出的数据相结合，对内型进行精准评估。基于这些丰富的数据，我们将建立内型与临床表型及免疫参数之间的关联，从而更深入地理解疾病机制。接下来，我们将开展验证试验，利用这些新定义的内型对患者进行分层，结合新的治疗方案或至少进行结果预测分析，以验证内型的临床应用价值。一旦内型得到验证，我们将把最有前景的内型调整为在常规临床实践中易于实施的检测。在利用高维数据进行探索性阶段之后，可以使用更简单的医疗测试系统（例如，仅测量定义内型所必需的少数参数）来定义内型的生物标志物特征。最后，我们将把脓毒症精准医疗的成功概念验证推广到不同的环境中，包括努力将这些知识传授给发展中国家。

图3：迈向脓毒症免疫治疗的步骤。脓毒症精准医学的“阶梯”：一个将数据驱动的免疫内表型引入临床实践的迭代过程。

      从理论上看，这种方法具有在未来几年为脓毒症免疫治疗的研究与发展提供明确蓝图的优势，但在临床层面，由于脓毒症复杂的病理生理机制以及疾病在多个层面（病原体类型、受累器官、免疫状态以及极端的疾病动态）上的异质性，这仍然是一个充满挑战的过程。遵循精准医学的理念和原则，在脓毒症治疗中成功应用免疫治疗，不仅需要长期投入资源，还需要推动国际标准化，并建立能够执行这些迭代过程的网络。这对于产生普遍适用、具有价值的见解至关重要，这些见解能够弥合高维分子研究与临床实践之间的鸿沟。最近，基于组学的新方法在识别脓毒症免疫治疗新靶点方面展现出了巨大潜力，但这些方法仍需在临床试验中进行测试和验证，并随后在常规临床实践中得到应用。这一过程不仅需要跨学科的合作与努力，还需要建立严格的评估体系，以确保新发现的科学性和临床实用性。

      脓毒症是医疗保健领域的一项重大挑战，无论是在中低收入国家还是高收入国家，它都是社会负担最重的疾病之一。过去几十年中，我们对脓毒症病理生理学的异质性有了深入的了解，这种异质性源于多种致病微生物与高度调控的免疫反应之间的相互作用。一个复杂的图景逐渐显现，其中基于免疫的病理生理紊乱对脓毒症的结果至关重要，这些紊乱在不同个体和疾病过程中可能有所不同，从过度炎症反应到免疫麻痹状态。这种异质性是20世纪90年代和21世纪初“一刀切”免疫治疗方法失败的主要原因之一，导致对脓症免疫治疗的投入不足。过去十年中，我们利用最新的技术发展来研究脓毒症，其中基于组学的方法在识别脓毒症免疫内型方面发挥了重要作用。这为我们基于新型诊断和治疗手段，丰富队列和采用精准医疗方法进行脓症免疫治疗开辟了道路。然而，仍有许多挑战需要克服。因此，我们需要弥合基于系统医学技术的雄心壮志与临床实践挑战之间的鸿沟：应探索务实的方法，将尖端的基于组学的技术转化为现成的诊断工具。随后，复杂的系统医学方法应旨在提供务实且现实的新生物标志物和免疫治疗方法组合，以便在未来每所医院的临床实践中，在患者床边进行应用，而不仅仅是在高度专业化的学术中心。只有这样，我们才有机会将免疫治疗确立为未来几代人脓症治疗中的成功支柱。