冻伤，这个在寒冷季节里常见的皮肤损伤，不仅给患者带来痛苦，还可能留下难以消除的疤痕。但随着再生医学的飞速发展，我们或许已经站在了一个治疗革新的门槛上。
近日，北京协和医院临床医学研究所冷泠教授团队一项突破性的研究利用诱导多能干细胞（iPSC）衍生的皮肤类器官，在冻伤治疗领域取得了令人瞩目的进展。这项研究不仅有望减少冻伤引起的长期疤痕，还可能改变我们对冻伤后皮肤修复的认识。现在，就让我们深入了解这项研究，探讨它是如何为冻伤患者带来希望的曙光。
#1
研究背景
Background
冻伤是在寒冷环境下，特别是高原与极地地区常见的一种伤害。冻伤初期症状不明显，容易被患者和医生忽视，导致治疗延误，产生严重后果。目前，冻伤的主要治疗手段包括使用钙通道阻滞剂（尤其是硝苯地平）来扩张冻伤部位的毛细血管，改善微循环。然而，这些药物作用间接，起效慢，在冻伤发展到后期，出现血管麻痹和坏死时，效果减弱。此外，这些药物主要通过缓解皮肤细胞的缺血缺氧状态来发挥作用，而非直接作用于细胞本身，这会导致伤口愈合进程缓慢，增加感染和胶原重构不良的风险，最终可能留下长期疤痕。
鉴于现有治疗手段的局限性，研究者们正积极探索新的治疗方法，以促进冻伤伤口的快速愈合并减少疤痕形成。本研究旨在利用人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的皮肤类器官，结合明胶-羟基凝胶，作为冻伤治疗的新策略。皮肤类器官包含多种细胞类型，具有与相应器官相似的空间组织和部分功能，能够模拟皮肤在体内的微环境，为冻伤治疗提供了一种潜在的无疤痕修复方法。
#2
研究思路
Methods
利用冻伤小鼠模型评估冻伤后的恢复过程。
运用单细胞转录组学分析冻伤后单核细胞、巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞的变化模式。
构建hiPSC衍生的皮肤类器官，并将其与明胶-羟基凝胶结合，用于治疗冻伤。
#3
研究结果
Results
1. 小鼠冻伤皮肤病理及单细胞转录组分析
研究团队构建了冻伤循环诱导的小鼠皮肤全层伤口模型，观察冻伤愈合机制。模型小鼠皮肤颜色变深红，冻伤后24小时出现肿胀和瘀伤，病理分析显示炎症细胞增多。冻伤后3天伤口最为严重，毛细血管扩张，红细胞积聚，第7天观察到成纤维细胞积聚。Masson染色显示冻伤严重影响胶原蛋白表达和分布。采用单细胞转录组学分析发现，小鼠皮肤组织包含25种细胞类型，冻伤后免疫细胞比例显著增加，特别是单核细胞和巨噬细胞，表明它们在冻伤后组织修复初期促进免疫反应中发挥重要作用。进一步分析单核细胞和巨噬细胞亚型发现，非经典单核细胞可能主要向中间和经典单核细胞转化，M2巨噬细胞比例略有增加。冻伤后第3天，上皮细胞比例显著增加。第7天成纤维细胞比例增加，表明可能参与ECM重塑（图1）。
图1
2. 冻伤后不同细胞类型基因表达变化的单细胞水平分析
通过对比分析，研究人员发现，在冻伤后第1天，免疫细胞（特别是巨噬细胞和单核细胞）中大量基因上调，主要涉及炎症反应和炎症因子释放的调节。同时，郎格汉斯细胞中部分与皮肤屏障和角质化相关的基因下调。到冻伤后第3天，上皮细胞中上调的基因主要富集在表皮发育、干细胞分化和皮肤屏障等功能上，表明这些细胞在重新表皮化过程中发挥重要作用。此外，内根鞘细胞中的干细胞分化相关基因也上调，可能同样贡献于重新表皮化。与此同时，部分成纤维细胞中的基因也开始发生变化，虽然具体功能各异，但已有部分细胞开始为后续的ECM重塑和神经系统调节做准备。到了冻伤后第7天，成纤维细胞中的基因表达发生显著变化，主要表现为基质组装、神经发育和成纤维细胞增殖等相关基因的上调，这表明，在冻伤后第7天，有更多的成纤维细胞实现对神经系统、血管再生以及免疫或ECM微环境的调节（图2）。
图2
3. 皮肤类器官减轻冻伤模型小鼠的炎症反应
研究人员采用与之前相同的方法构建了皮肤类器官，并验证了其表达多种细胞标记物。随后，这些皮肤类器官被固定并移植到冻伤模型小鼠中，以评估其对冻伤皮肤的治疗效果。结果显示，皮肤类器官移植促进了冻伤皮肤的伤口愈合，显著改善了炎症和血管损伤，并加速了胶原蛋白表达的恢复。研究发现，皮肤类器官移植降低了冻伤初期皮肤组织中免疫细胞的比例，表明类器官治疗可能调节冻伤初期的免疫反应。
与正常小鼠相比，冻伤模型小鼠的这些免疫细胞中存在大量差异表达的基因，这些基因可能是导致免疫细胞激活和炎症因子调节失衡的关键因素。然而，在经皮肤类器官处理的冻伤模型小鼠中，部分差异表达基因恢复到正常水平。生物通路分析显示，这些恢复表达的基因主要与趋化因子信号、Toll样受体信号和NOD样受体信号相关。此外，单细胞转录组分析和病理染色结果发现，皮肤类器官治疗减少了冻伤皮肤组织中CCL4和IL6等炎症因子的表达。这表明皮肤类器官治疗可以减少冻伤造成的伤口的炎症反应，可能通过防止受损组织中炎症因子的反复激活导致过度的炎症反应（图3、4）。
图3
图4
4. 冻伤模型小鼠组织修复过程中皮肤类器官促进表皮细胞功能
再上皮化是皮肤愈合的关键步骤，由基底层表皮干细胞增殖和分化驱动。皮肤类器官移植后，冻伤皮肤组织中表皮干细胞标记物KRT14表达增加，表明再上皮化得到增强。通过单细胞轨迹分析，发现皮肤类器官治疗能纠正冻伤导致的基底层干细胞和毛囊细胞发育轨迹异常。此外，类器官治疗还能使冻伤后表皮细胞中部分基因表达恢复正常水平，这些基因涉及皮肤衰老、炎症、凋亡、细胞骨架组织、表皮发育、毛囊发育和神经再生等方面。特别是，Cd63和Map3k5在基底层表皮细胞中表达，对黑素细胞发育和细胞命运决定至关重要。免疫荧光
验证显示，皮肤类器官治疗能增加冻伤后CD63和MAP3K5的表达。因此，皮肤类器官治疗可能通过调节基底层皮肤干细胞/祖细胞中的基因表达，促进冻伤皮肤损伤的再上皮化，从而实现快速伤口修复（图5）。
图5
5. 皮肤类器官介导的成纤维细胞ECM重塑调控
既往研究显示，趋化因子和促炎因子增加可引发慢性炎症，导致ECM异常重塑和疤痕形成。为探究冻伤后皮肤成纤维细胞中ECM成分的基因表达变化，研究者在冻伤后第3天和第7天进行了比较。结果发现，第7天时多种ECM成分的基因表达上调，而下调的基因表达也涉及多种ECM成分。特别地，成纤维细胞5表现出最多的ECM相关基因失调，且其高水平表达的ECM成分中有一些与疤痕形成有关，另一些则参与胶原合成、组织结构、降解和ECM重塑的调节。此外，皮肤类器官治疗后的冻伤组织中，多种上调和下调的ECM表达几乎恢复到正常水平，且免疫组化染色结果也支持这一点。CST6和CLIP等分子的表达变化提示它们可能参与调节胶原纤维与ECM的合成和降解，影响疤痕形成。因此，皮肤类器官治疗可能通过调节成纤维细胞分泌的ECM表达水平来抑制冻伤后的疤痕形成。
6. 皮肤类器官处理抑制冻伤小鼠成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的过程
研究人员进行了单细胞水平分析，结果显示，冻伤后皮肤组织中成纤维细胞数量增加，但皮肤类器官治疗后成纤维细胞比例下降，特别是成纤维细胞1和可能参与疤痕形成的成纤维细胞5的比例降低。进一步分析发现，成纤维细胞5表达高水平的Hhip和Vim，表明其可能是肌成纤维细胞。肌成纤维细胞在组织修复和疤痕形成中起关键作用，其过度活动可导致疤痕组织过度形成和收缩。免疫荧光染色显示，皮肤类器官治疗可降低冻伤后肌成纤维细胞标志物MYH2的表达，减少肌成纤维细胞数量。此外，伪时间分析表明，皮肤类器官处理可能通过调节成纤维细胞向肌成纤维细胞的转变来减少肌成纤维细胞数量。同时，皮肤类器官可以抑制整合素α5β1-FAK通路，减少从成纤维细胞到肌成纤维细胞的过度转变，这一发现在细胞和组织水平均得到验证（图6）。
图6
7. 皮肤类器官抑制冻伤中疤痕的形成
研究人员发现，皮肤类器官处理能调节肌成纤维细胞的基因表达，使一些关键基因如Cst6、Ifrd1、Col1a1和Col3a1恢复到正常水平，这些基因与细胞增殖、信号转导、蛋白酶活性调节及疤痕组织形成有关。此外，皮肤类器官处理还能改善冻伤后胶原蛋白的异常聚集和分布，以及能量代谢的紊乱，同时保护毛囊结构。这些作用有助于减少疤痕形成，因为皮肤类器官能控制真皮成纤维细胞中的ECM表达、胶原排列、能量代谢和ECM酶系统，从而抑制疤痕的形成并促进疤痕的修复和重塑（图7、8）。
图7
图8
小结
本研究中，研究团队采用了一种创新的方法——利用hiPSC衍生的皮肤类器官来治疗冻伤。研究发现，将这些皮肤类器官移植到冻伤小鼠模型中，可以显著加速伤口愈合，有效减轻炎症反应，并激发皮肤干细胞的增殖与分化，进而加速皮肤修复进程。更重要的是，这种治疗方法还能够调节细胞外基质的重构，减少疤痕形成，这对于改善冻伤愈合效果和减少长期疤痕具有重要意义。
此研究的价值不仅在于为冻伤治疗提供了一种潜在的无疤痕解决方案，更彰显了干细胞技术在组织损伤修复领域的巨大潜能。随着技术的不断进步，我们期待这种方法能够在未来广泛应用于临床治疗中，帮助更多冻伤患者恢复健康的皮肤。
参考文献
Wang W, Liu P, Zhu W, Li T, Wang Y, Wang Y, Li J, Ma J, Leng L. Skin organoid transplantation promotes tissue repair with scarless in frostbite. Protein Cell. 2024 Oct 4:pwae055. doi: 10.1093/procel/pwae055. Epub ahead of print. PMID: 39363875.
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