文献精读:具有快速自定相和多级编程功能的可喷涂仿生双层膜,用于无疤痕伤口愈合

学术   2024-11-11 19:50   新疆  
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初稿:黄伟(23级药学专业 硕士)

审核:王坤(温州医科大学 讲师)

定稿:徐捷(24级生物学专业 博士)



知识点1 —  电感耦合等离子体发射光谱法

    电感耦合等离子体发射光谱法Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy,ICP-OES)是一种高灵敏度和高精度的分析技术,用于测定样品中多种元素的含量。CP-OES通过将样品引入高温等离子体中,使样品中的元素原子化并激发,然后通过检测这些元素发出的特征光谱来确定其含量。

优点:1高灵敏度:ICP-OE可检测到ppb十亿分之一)甚至更低浓度的元素;(2)多元素分析:一次分析可以同时测定多种元素,提高分析效率;(3)宽动态范围:可以从低浓度到高浓度的样品中进行准确测定;(4)基体效应小:等离子体的高温可以有效消除基体效应,提高分析的准确性。



知识点2 — 光交联

  光交联Photo-Crosslinking)是一种利用光(通常是紫外线或可见光)引发化学反应,使聚合物链之间形成共价键或物理交联,从而形成三维网络结构的技术。光交联在材料科学、生物医学工程、药物递送和组织工程等领域有广泛的应用。

优点:(1)快速固化,光交联反应通常在几秒到几分钟内完成,大大缩短了固化时间,提高了生产效率。可以在特定时间和地点进行交联反应,适用于现场施工和即时应用;(2)精准控制,通过光的聚焦和扫描,可以实现对交联区域的精确控制,适用于微纳尺度的加工和图案化。通过控制光的照射时间和强度,可以精确调节交联程度,实现对材料性能的精细调控;(3)低温固化,光交联通常在室温下进行,不需要高温设备,降低了能耗和成本。适用于对温度敏感的材料,如生物分子、蛋白质和细胞等,避免了高温对材料的损害。



知识点3 — 激光多普勒灌注成像

激光多普勒灌注成像Laser Doppler Perfusion Imaging, LDPI是一种非侵入性的成像技术,用于评估组织的血流灌注情况。这项技术基于激光多普勒效应,通过检测激光在组织中的散射和多普勒频移,可以量化血流速度和血流量。LDPI在医学和生物学研究中有着广泛的应用,尤其是在皮肤、肌肉、脑组织等的血流灌注评估中。
优点:(1)非侵入性,不需要插入导管或注射造影剂,对患者无创;(2) 实时监测,可以实时监测血流变化,适用于动态研究;(3) 高分辨率:提供高空间分辨率的血流灌注图像,能够详细显示局部血流情况;(4)多功能,可以用于多种组织和器官的血流评估,如皮肤、肌肉、脑组织等。

Title: Sprayable biomimetic double mask with rapid autophasing and hierarchical programming for scarless wound healing

Authors: Yuhe Yang#Di Suo#Tianpeng Xu#Shuai ZhaoXiaoxiao XuHo-Pan BeiKenneth Kak-yuen WongQibin LiZijian Zheng*Bin Li*Xin Zhao*


Sci. Adv.

DOI: 10.1126/sciadv.ado9479


引言

目前市面上的可喷涂水凝胶敷料无法为大面积伤口提供分阶段的保护、清洁和营养,导致伤口愈合延迟并留下疤痕。香港理工大学郑子剑教授(通讯作者)、赵昕教授(通讯作者),苏州大学李斌教授(通讯作者)团队开发了一种可喷涂的仿生双层膜(BDM),具有快速自定相和分层编程,用于无疤痕伤口愈合。BDM包括疏水性聚(丙交酯-共丙二醇-共丙交酯)二甲基丙烯酸酯(PLD)作为顶层和亲水性明胶甲基丙烯酸酯(GelMA)水凝胶作为底层,能够迅速自定相(根据各自的性质自我分离)化为双层结构。光交联后,BDM迅速凝固,具有很强的界面结合、强大的组织粘附力和出色的接头适应性。应用于伤口后,底层GelMA可以立即释放钙离子以快速止血,而顶层PLD层可以保持湿润、透气和无菌的环境。这些性状协同抑制炎性肿瘤坏死因子通路,同时协调环cGMP/PKG-Wnt/Ca2+信号通路以滋养血管生成。总的来说,BDM具有双层结构的自我调节结构,可以分层编程愈合进程,具有无疤痕伤口愈合的变革潜力。


1:具有快速自定相和分层编程的可喷涂BDM,用于无疤痕伤口愈合示意图

A)疏水性PLD和亲水性GelMA在混合和喷涂后迅速自定相成双层结构,光交联后形成BDM,具有很强的界面结合、强大的组织粘附力和对关节运动的出色适应性。PPG,丙二醇;PGLA,聚(丙交酯-共丙二醇-共丙交酯)。(B)具有逐步止血、维持湿润、透气和无菌环境以及血管生成营养的BDM可以通过抑制炎性TNF-α途径,增加M2巨噬细胞极化,促进炎症表型向增殖表型的转变,分层次编程动态愈合级联,实现无疤痕伤口愈合。同时激活和协调cGMP/PKG-Wnt/Ca2+信号通路,促进血管重建和无疤痕伤口愈合。


2:可喷涂BDM的制备和表征

AGelMAG)和PLD溶液在储备状态下以及混合后5 s15 s的自定相能力评估。原始的GelMAPLDG-PLD)在原液状态下可以形成明显的两层,但它们在混合后形成乳液,并且在15秒后无法恢复双层结构。含有5 wt%CaCl2G/Ca5)和10 wt%CaCl2G/Ca10)的GelMA在充分混合后可以保持5 s的均匀混合状态,并在15 s内自发恢复双层结构。相比之下,加入15%CaCl2G/Ca15)的GelMA在混合后立即恢复了双层结构(<5 s)。(BG/Ca5-PLDG/Ca10-PLD组在100 s内均呈现独特的双层结构。G/Ca10在交联后可以与PLD形成无缝界面,表明两相之间的紧密结合。(C)由于GelMAPLD之间形成共价键,G/Ca5-PLDG/Ca10-PLD组的界面结合强度(G/Ca5-PLD~534 kPaG/Ca10-PLD~576 kPa)明显高于对照组(G/Ca5 + PLD~37 kPaG/Ca10 + PLD~72 kPa)。(D)通过爆破释放测试来评估BDM的粘合性能,并使用商业纤维蛋白胶作为对照。G/Ca5G/Ca10基团表现出很强的组织粘附性,这是由于GelMA与组织之间形成了氢键,GelMA的甲基丙烯酰基与组织的胺基之间形成了共价键。(E)通过具有强组织粘附力的可喷涂BDM的快速实施和关节运动适应的演示,发现BDM可以迅速构建,对手关节具有强大的粘附力和出色的运动适应能力。


3:使用自定相BDM实现快速止血

A)显示了具有Ca2+释放以调节凝血级联反应能力的自定相BDM。(BC)使用商业纤维蛋白胶作为对照进行体外全血凝固测定,使用电感耦合等离子体发射光谱法进行Ca2+浓度测定。由于血小板聚集活化,与空白组相比,GelMA和纤维蛋白胶的凝血时间缩短,值得注意的是,G/Ca5G/Ca10组的凝血时间明显加快,分别为~3.8~3.2 min,这可能是由于Ca2+BDM中大量释放。Ca2+在两组中都可以在5 min内爆发释放,这与GelMA的亲水性和松散的聚合物网络有关。(D-FCa2+释放动力学通过调节血凝和血小板聚集对初级凝血起决定性作用。进一步评估了红细胞(RBC)和血小板在材料上的附着。可以发现G/Ca5G/Ca10组红细胞吸收比空白组增加了2.8倍和3.0倍。此外,G/Ca5G/Ca10组的血小板粘附也比空白组增加了~2.2~2.3倍。(G)切开肝脏后,在伤口部位应用了多种BDM并进行光交联处理。可以发现,尽管存在大量出血,BDM并未受到干扰,仍能有效地在应用部位形成伤口敷料,牢固地附着在组织上。(H-J)通过止血时间和滤纸上的血痕来评价各组的止血效果。可以发现G/Ca10组在~2.1 min内完全止血,而对照组和纤维蛋白胶组分别在5 min3.1 min左右。与其他组相比,G/Ca10组的失血量也显著减少。


4:使用自定相BDM维持潮湿、可渗透和无菌的环境

A)上层PLD起到仿生表皮的作用,以有效维持湿润、透气和无菌的环境(被广泛认为是伤口自然愈合的关键要素)。(B)通过量化暴露在空气中的保水率来评估BDM的长期湿润维持能力。发现纤维蛋白胶组由于不可控的水分蒸发而迅速失去水分。G/Ca5G/Ca10组的水潴留增加。这可能是由于CaCl2具有优异的吸水能力。值得注意的是,BDM具有持久的保水能力,14天后保水率超过70%,这是由于上层疏水PLD层的存在和CaCl2的掺入,可以大大减少水的挥发。这种持久的湿润可以确保伤口在再生过程中持久的水合作用。(CD)通过量化水蒸气透过率(WVTR)来评估BDM的受控渗透能力。发现裸露的水凝胶基团(即G/Ca5G/Ca10和纤维蛋白胶)表现出WVTR(超过~170 g/h/m2),这可能是由于水凝胶的多孔结构导致伤口快速脱水。相反,具有致密微观结构和高疏水性的PLD组,其WVTR通透性明显降低(~33 g/h/m2),可能导致感染并延迟伤口愈合。可以观察到BDM(例如G/Ca5-PLDG/Ca10-PLD)的WVTR分别为~80~85 g/h/m2,这可能归因于其独特的双层结构。该WVTR值接近令人满意的伤口敷料WVTR范围(~80100 g/h/m2)。(E)使用异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)作为模型污垢剂,通过蛋白质吸收评估来表征BDM的防污性能。可以发现亲水性G/Ca5G/Ca10和纤维蛋白胶基团呈现明显的荧光信号,表明蛋白质大量吸附。然而,具有致密和疏水性PLD顶部的BDM(例如G/Ca5-PLDG/Ca10-PLD)显示出可忽略不计的荧光,表明BDM具有出色的防污能力。(F-H)通过大肠杆菌(革兰氏阴性)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性)的圆盘扩散法评估了不同样品的杀菌能力。接触24小时后,发现与PLD组相比,掺入三氯生(TriclosanTCSPLD对两种细菌都表现出明显的抑制区。与PLD/TCS2.5组相比,PLD/TCS5PLD/TCS10组显示出显著更大的抑制面积。PLD表现出14天的TCS持续释放,这对于整个伤口恢复周期的有效细菌抑制至关重要。(IJ)使用14天后的条件样品进行铺板法来评估其长期抗菌活性。可以发现PLD/TCS5PLD/TCS10组仍然具有几乎100%的抗菌能力,证实了其长期抗菌性能。


5:自定相BDM滋养血管生成

AB胶原酶CL+)组均能使L-精氨酸释放持续14天。G/Ca5G/Ca10组在止血阶段初始爆发释放后,剩余Ca2+持续释放14天。且G/Ca10Ca2+释放量高于G/Ca5组。(C)显示释放的Ca2+L-精氨酸与NO生产的协同滋养作用。L-精氨酸和Ca2+的存在有望通过促进NO合成来滋养血管生成。(D)测量了不同条件培养基的人脐静脉内皮细胞HUVECs)中内皮一氧化氮合酶(eNOS)的表达水平。发现在Ca2+释放的G/Ca5G/Ca10组细胞中,eNOS表达显著升高,这表明Ca2+可以以剂量依赖的方式增加eNOS表达。(E)测量了HUVECsNO产量,发现那些释放L-精氨酸和Ca2+HUVECs可以产生更多的NO。(FG)发现G/Ca5CL+)和G/Ca10CL+)在孵育24小时后表现出显着更快的迁移和伤口闭合速率,证实了NO增强细胞迁移的能力。(H-J)孵育6小时后,观察到G/Ca5CL+)和G/Ca10CL+)中形成了更多的管状结构。特别是,与空白组相比,G/Ca10CL+)组的分支点增加了~3.2倍,表明其促进血管形成的特殊潜力。此外,血小板内皮细胞粘附分子(CD31)是血管生成的综合制造者,被发现表达类似的趋势。


6BDMs在全层大鼠皮肤伤口模型中实现了无疤痕伤口愈合

A使用金黄色葡萄球菌感染的全层大鼠皮肤伤口模型评估了BDM的治疗伤口愈合效果。以PLD/TCS5G/Ca10单层膜和市售纤维蛋白胶为对照。B)发现BDM组的伤口面积比其他组小。相反,G/Ca10和纤维蛋白胶组在用黄色渗出物和覆盖伤口的脓液治7天后发生细菌感染。C)愈合图显示,BDM组在14天后几乎完全愈合,初始伤口面积不到10%,而其他组则表现出明显的愈合切片不完整。(DE)伤口面积和伤口愈合率量化进一步证实了BDM显着加速的伤口愈合过程。(F)采用苏木精和伊红(H&E)染色评估皮肤组织的动态愈合进展。第3天,空白组和G/Ca10组小鼠出现明显炎症反应,免疫细胞浸润,可能是细菌感染和快速脱水所致。相反,BDM组炎症明显减轻。随后在第7天,观察到最初的上皮组织形成,BDM组表现出更明确的肉芽组织再生,死亡间隔最小。最后,14天后,BDM处理的伤口表现出明显的皮肤再生,皮肤表面连续,瘢痕形成不明显。(GH)表皮厚度定量分析显示,BDM组表皮厚度最大(~23 μm),与健康表皮非常接近。此外,BDM组毛囊密度增加(~8.3/mm2),分别比空白组和纤维蛋白胶组高5.66倍和2.44倍。与正常皮肤(~9.7/mm2)相比,毛囊密度的增加表明BDM可以诱导重塑过程的重构,同时抑制疤痕的形成。


7BDM在分层编程无疤痕伤口愈合中的转录组学分析

A)收集了伤口组织并在第3天和第7天进行了转录组学分析(BDM组与空白组),分别针对炎症和增殖阶段。第3天,观察到广泛的差异基因表达(DGE),火山图显示2536个基因上调,1527个基因下调。(BC)进行京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析,发现TNF-α和白细胞介素-17IL-17)信号通路显著下调,这两个信号通路与促炎M1型巨噬细胞极化有关。此外,描绘这些通路中差异表达基因的热图显示出显著的下调(例如,基质金属蛋白酶(MMP3),肿瘤坏死因子(TNF),白细胞介素(IL-1αIL-1β)和趋化因子(CCL3)),或上调(例如角蛋白(Krt2Krt3),视黄醇X受体γRxrg)和碱性神经酰胺酶(Acer1))。(D)此外,诱导型一氧化氮合酶(iNOS)(M1标记物)、CD163M2标记物)和CD68M0标记物)的免疫荧光染色显示,BDM能有效促进巨噬细胞M2极化,M1比显著降低(10.6% ± 2.3%),M2比显著升高(17.6% ± 1.32%),M1/M2比最低(0.59% ± 0.11%)。(EBDM创造了快速止血和潮湿、透气的无菌环境,可以通过增加M2巨噬细胞极化来抑制早期炎症,并编程从炎症到增殖的愈合级联反应。(F)第7天,火山图呈现3225个上调基因和1752个下调基因。(GKEGG分析进一步揭示了Wnt信号通路和环磷酸鸟苷(cGMP/依赖蛋白激酶GPKG)信号通路的上调,它们在促进血管生成以促进增殖伤口愈合中起关键作用。(h)热图显示了关键差异表达基因,Wnt5a、卷曲类受体(Fzd7)、蛋白激酶CPrkcaPrkg2)和内皮型一氧化氮合酶(NOS3)的上调,进一步证实了这些通路的激活。(J)增殖阶段血管生成的增强可能是由cGMP/PKG-Wnt/Ca2+信号通路的协同激活和协调引起的。


8BDM促进全层皮肤创面模型的创面愈合

A)建立了猪全层伤口模型,在整个愈合过程中BDM大大加快了伤口闭合。到第7天,BDM释放的TCS显着减少了伤口部位的感染,减少了炎症反应。(BGBDM组创面面积下降至83.6%左右,空白组创面面积为95.1%,纤维蛋白胶组创面面积为91.2%。到第28天,BDM组的伤口几乎完全愈合,而对照组的伤口仍有50%未愈合。组织学H&E染色分析显示,BDM组肉芽组织宽度明显窄于其他组,表明新形成的组织中瘢痕增生极少。(CMasson三色染色显示BDM组胶原沉积最广泛,表明BDM在伤口愈合过程中促进胶原重建的有效性。(DHH&E染色定量RBC灌注与管腔结构形成。可以发现BDM组有更多的新形成的血管腔结构,分别是对照组和纤维蛋白胶组的2.13倍和1.57倍,突出了其优越的血管生成能力。(E)进行激光多普勒灌注成像,发现BDM组表现出最高的血流通量,比纤维蛋白胶高1.74倍,表明功能性血流的重建。


小结

综上所述,该团队开发了一种具有快速自适应和分层规划的可喷涂BDM,用于广泛伤口的无疤痕愈合。可喷涂BDM由光交联疏水PLD聚合物和亲水GelMA水凝胶组成。通过自发的水/油分离,两相迅速自相成双层结构。光交联后,BDM显示出强大的界面键合,强大的组织粘附性和对关节运动的良好适应性。此外,BDM可编程地刺激动态愈合级联。底部GelMA层快速释放Ca2+止血,而顶部PLD层保持湿润、透气、无菌的环境,从而协同抑制炎症性TNF-α通路,增加M2巨噬细胞极化。BDM可以协同激活和协调cGMP/PKG-Wnt/Ca2+信号通路,以增强血管重建和促进无疤痕伤口愈合


上述研究成果在Science Advances上在线发表,题为“Sprayable biomimetic double mask with rapid autophasing and hierarchical programming for scarless wound healing”。香港理工大学杨雨禾、索迪和徐天鹏为论文的共同第一作者,香港理工大学郑子剑教授赵昕教授,苏州大学李斌教授,为论文共同通讯作者


原文链接:

https://doi.org/10.1038/s41467-024-45094-5

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