院内感染或医疗保健相关感染（HAI）可能发生在医疗服务提供期间或出院后。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是导致HAI的主要原因之一，由于其对所有现有的青霉素类药物和大多数现有的β -内酰胺类抗生素，包括甲氧西林、阿莫西林、苯氧西林、头孢菌素等具有耐药性，使其变得难以治疗。抗生素耐药性的上升可能会导致回到抗生素存在之前的时代，为了避免这种情况发生，需要开发新的抗微生物药物和策略。
作者探索了使用基于纳米技术的方法来治疗细菌生物膜感染，通过将分子材料部署到宿主细胞中，以促进AMP的表达并减少感染伤口小鼠模型中的细菌负担。成功地将CAMP转染到创面边缘，细菌生物膜负荷显著减少，这可能是由体内释放携带LL-37/CAMP的EVs介导的。此外，还观察到血管化和巨噬细胞浸润的增加。该发现强调了在抗菌治疗中使用TNT介导的核酸递送的潜在用途。
图1.体外评价的实验设置示意图和转染上皮细胞的表达分析及假转染和CAMP-转染细胞分离出的EV的低温电镜显微照片。
为了验证电转染CAMP屏障细胞增加抗菌防御的假设，用编码小鼠抗菌肽（CAMP）的表达质粒电转染小鼠原代上皮细胞。qRT-PCR分析显示，与假转染细胞相比，CAMP转染细胞在不同时间点的CAMP表达显著增加。在转染后6至24小时观察到CAMP持续上调，在48小时下降，可能是由于未转染细胞的增殖。此外，在转染12小时后，与假转染细胞相比，CAMP转染细胞释放的LL-37量显著增加。当金黄色葡萄球菌与CAMP转染的细胞共接种时，与对照组相比，细菌存活率显著降低。还通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）、冷冻电镜（cryo-EM）、Western blot和全内反射显微镜（TIRFM）图像检测对EVs进行表征（图1）。
图2.通过体外实验评估CAMP负载EVs的摄取动力学及其对naïve上皮细胞CAMP表达的影响。
荧光显微镜分析显示，在暴露12 小时后， EVs就被细胞内化。为了验证来自EV的绿色荧光信号特异性位于细胞边界内，使用细胞质染色并证实了绿色荧光EVs信号在细胞质边界内的定位。还通过使用溶酶追踪器染料进一步证实了基于内吞的EVs内化，在所有时间点上，CAMP-EVs被细胞内化的速度比假EVs更快，虽然在12小时或24小时暴露期间没有观察到CAMP-EVs摄取的显着差异，但相对于12小时，24小时的摄取明显增加。免疫组织化学分析显示，暴露于CAMP-EVs的细胞中CAMP蛋白的数量显著增加。综合以上结果可知，来自CAMP转染细胞的EVs可以被屏障细胞优先捕获，并且这种EVs可以驱动旁腺中其他细胞的抗菌有效载荷过表达（图2）。
图3. 感染伤口小鼠模型的体内实验和放置在表皮上的TNT芯片与创面及周围皮肤接触实验。
为了确定体外电转染CAMP可导致屏障细胞产生更多的LL-37肽，从而增加对金黄色葡萄球菌的抗菌活性，并鉴定转染细胞分泌的EVs装载/关联CAMP mRNA转录物和LL-37肽，从而验证其扩增/传播抗菌信号的能力。测试了伤口边缘的CAMP的TNT是否可以在金黄色葡萄球菌感染伤口的小鼠中引起类似的反应。IVIS成像证实所有组均成功且一致地建立了金黄色葡萄球菌感染。为了证实TNT处理后感染的程度，在第5天通过收集组织并进行菌落形成单元电镀来量化实际细菌负荷。结果显示，与未处理伤口相比，CAMP处理伤口的细菌负荷显著降低约2个数量级。通过组织切片的免疫荧光显微镜表明，与未治疗和假治疗的感染伤口相比，金黄色葡萄球菌感染的组织面积百分比减少了约60%（图3）。
图4.TNT处理后第5天的代表性免疫荧光显微图和巨噬细胞浸润面积、内皮标记物百分比面积。
继续评估CAMP的过表达是否引发了其他已知的多效性，包括血管生成和免疫调节，对收集的损伤组织的进一步分析显示，纳米转染CAMP的动物显示F4/80（组织巨噬细胞的标记物）的显著增加，表明这些免疫细胞的浸润增强。与此同时，与对照组相比，纳米转染CAMP的动物在第5天内皮标志物CD31的表达有统计学意义的增加（图4）。
图5.组织纳米转染（TNT）的CAMP编码质粒在小鼠皮肤上的实验和假转染或CAMP纳米转染皮肤相对于未转染皮肤的CAMP基因表达的qPCR分析。
为了进一步扩展我们基于EVs的抗菌物质转移作为潜在作用机制的体外研究，进一步测试了纳米转染CAMP质粒的皮肤组织是否也释放含有CAMP mRNA转录物和LL-37肽的EVs。在TNT后24小时采集皮肤活检。与对照组（未转染和假转染的皮肤）相比，纳米转染的组织显示CAMP基因表达显著增加。对皮肤活检组织进行酶消化、过滤、离心和沉淀，以分离从转染区域释放的EVs。颗粒的尺寸分布在30 ~ 350 nm之间，平均粒径为90-100 nm。此外，CAMP转染组织释放的EVs中CAMP基因拷贝数显著高于对照或假转染组织。同样，来自CAMP转染皮肤的EVs中LL-37肽含量显著高于对照或未转染皮肤（图5）。
用编码抗菌肽的质粒对皮肤/伤口区域进行组织纳米转染，可以有效地减少金黄色葡萄球菌感染伤口的细菌。此外，TNT介导的核酸递送可能被来自转染细胞的EVs放大，从而提供了将治疗传播到转染组织周围部分的手段。而这是第一个显示AMP（如LL-37）有效加载到EVs中的报告，以及它们有效转染受体细胞以抑制细菌负载的潜力。总的来说，使用这种递送方法作为一种可行和安全的策略，可以部署新的治疗有效载荷，用于生物膜感染和伤口愈合。
近期，该研究成果以“Tissue nano-transfection of antimicrobial genes drives bacterial biofilm killing in wounds and is potentially mediated by extracellular vesicles”为题发表于学术期刊《Journal of Controlled Release》，论文第一作者为Tatiana Z. Cuellar-Gaviria，通讯作者为约翰霍普金斯大学Daniel Gallego-Perez。
撰稿人：李克江
审稿人：冉博文
论文全文链接
https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2024.10.071
抗菌抗污材料前沿
长按二维码关注
获取最新科研消息
