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初稿：杨佳宜（23级药学专业 硕士）、朱一挺（21级药学专业 本科生）简介
TUNEL染色，即脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal Deoxynucleotidyl
Transferase-Mediated dUTP Nick End Labeling），是一种常用的细胞凋亡检测方法。TUNEL染色是一种将分子生物学与形态学相结合的研究方法，可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，准确地反映细胞凋亡典型的生物化学和形态特征。该方法可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因此在细胞凋亡的研究中被广泛采用。
原理
在细胞凋亡过程中，染色体DNA会发生双链断裂或单链断裂，产生大量的粘性3′-OH末端。TUNEL染色利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3′-OH末端，从而可以特异性地检测凋亡细胞。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因此很少能够被染色。
特点
1. 特异性高
针对凋亡细胞：TUNEL染色法专门用于检测凋亡细胞中的DNA断裂，对正常细胞或增殖细胞中的DNA无影响。标记准确：通过末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）将标记物特异性地结合到DNA断裂的3'-OH末端，确保标记的准确性。2. 灵敏度高
早期检测：TUNEL染色法能够在细胞凋亡的早期阶段检测到DNA断裂，为及时干预和治疗提供可能。低背景信号：由于标记物与DNA断裂部位的特异性结合，背景信号较低，提高了检测的灵敏度。3. 操作简便
步骤清晰：TUNEL染色法的实验步骤相对清晰明了，包括样本准备、TdT酶反应和标记物检测等阶段。商业化试剂盒：市场上已有多种商业化TUNEL染色试剂盒可供选择，进一步简化了实验操作。4. 适用范围广
多种样本类型：TUNEL染色法适用于多种样本类型，包括组织切片、培养的细胞和分离的细胞等。多种检测手段：根据实验需求，可以选择荧光显微镜、流式细胞仪或光学显微镜等不同的检测手段。5. 可视化效果好
荧光标记：使用荧光素标记的dUTP进行TUNEL染色，可以在荧光显微镜下观察到凋亡细胞的形态和分布。颜色反应：使用过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的dUTP进行TUNEL染色，可以通过颜色反应（如DAB显色）在光学显微镜下观察到凋亡细胞。6. 可定量检测
流式细胞仪：通过流式细胞仪对TUNEL染色后的细胞进行定量检测，可以准确计算出凋亡细胞的比例。图像分析：使用图像分析软件对TUNEL染色后的组织切片或细胞进行定量分析，可以评估凋亡细胞的密度和分布。
步骤
（1）取待测的细胞爬片，用新鲜配制的PBS清洗，室温，3 min x 3次；（3）用新鲜配制的1 x PBS清洗，室温，5 min x 2次；（4）细胞爬片浸入0.2% TritonX-100溶液中，室温，5 min；（5）浸入新鲜配制的PBS中清洗，室温，5 min x 2次；（6）移去细胞爬片上多余的液体，滴加平衡缓冲液（equilibration buffer），每张片子100 μL，室温孵育5~10 min；（7）配脱氧核糖核苷酸末端转移酶（rTdT）反应液，每张细胞片100 μL；（8）移去细胞爬片上多余的液体，每张细胞片滴加100 μL rTdT反应液（避免细胞片变干），放入湿盒中，60 min；（9）用去离子水稀释柠檬酸钠缓冲液（1:10），倾去rTdT反应液，滴加柠檬酸钠缓冲液，室温，15 min，终止反应；（10）浸入PBS中清洗，去除未结合的生物素化的核苷酸，室温，5 min x 3次；（11）浸入0.3% H2O2溶液中，室温，3~5 min，阻断内源性过氧化物酶的作用；（12）浸入PBS中清洗，室温，5 min x 3次；（13）用PBS 稀释链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin
HRP）（1:500）,每张细胞片加100 μL，室温孵育，30 min；（14）浸入PBS中清洗，室温，5 min x 3次；（15）配制DAB染色液，避光，滴加100 μL DAB使用液至细胞片，显色，直到浅棕褐色背景出现，避免背景颜色过深；（17）切片于倒置荧光显微镜下观察并采集图像，分析。
常见问题与建议
1.固定：使用适当的固定剂（如4%多聚甲醛）固定细胞或组织，以保持细胞形态和DNA结构的完整性。根据细胞类型或组织特性优化固定时间，通常为10~30 min，但也可能需要更长的时间。2.通透：使用含有0.1% Triton X-100的PBS溶液处理细胞，以增加细胞膜通透性，使TUNEL反应混合物能够进入细胞内部。通透时间一般为5~10 min，但具体时间可能因样本类型而异。3.反应混合物配制：TUNEL反应混合物应在使用前新鲜配制，并在短时间内使用，避免长期保存导致酶活性失活。4.洗涤：在每个步骤后进行彻底且及时的洗涤，以去除未结合的试剂和底物，避免背景信号的干扰。洗涤缓冲液的成分和洗涤次数可根据实验需要进行优化。5.封片：用封片剂（如抗荧光淬灭封片剂）封片，以保护荧光信号并减少光漂白。
应用示例
1. 19-羟基蟾毒灵（19-Hydroxybufalin）作用后非小细胞肺癌（NSCLC）细胞的TUNEL染色
为了探索19-Hydroxybufalin对NSCLC细胞的自噬的影响，对NSCLC细胞进行TUNEL染色，TUNEL（红色）用于标记DNA片段，DAPI（蓝色）用于标记细胞核。TUNEL实验显示，DNA片段在24 h呈剂量依赖性上调，这表明细胞凋亡的发生。所以，19-Hydroxybufalin促进NSCLC细胞凋亡。
2. 大鼠肝组织TUNEL染色及评分
为了探索低温氧灌注（HOPE）的抗凋亡作用，通过TUNEL染色发现HOPE后，凋亡细胞细胞变少，加入AG490后，荧光信号增强，凋亡细胞增加，所以通过TUNEL染色发现HOPE能够调节内质网应激，具有抗凋亡作用。通过TUNEL染色也证实了AG490逆转了HOPE的抗凋亡作用。
3. 颗粒细胞（GCs）的TUNEL染色
为了探索SFRP4蛋白是否通过抑制卵巢 GCs中的AKT信号通路来促进自噬，并减弱促性腺激素（FSH）的反应性。GCs加或不加重组SFRP4蛋白（20 μg/mL）培养1h，然后加或不加FSH处理（50 ng/mL）。显微照片显示代表性的TUNEL分析，无论FSH存在与否，SFRP4都增加了发生凋亡的细胞比例（红色= TUNEL信号，蓝色=
DAPI反染）。
4. 小鼠肾组织的TUNEL染色
为了探索免疫预处理对免疫预处理对小鼠肾缺血再灌注损伤模型（IRI）的小鼠肾小管上皮细胞的凋亡的影响，对需要进行IRI的小鼠进行免疫预处理。IRI小鼠肾小管上皮细胞的凋亡分数明显高于对照组，而免疫预处理显著降低了IRI小鼠的凋亡分数。结果表明，免疫预处理可抑制IRI引起的肾细胞凋亡。文中采用TUNEL荧光法检测细胞凋亡，荧光信号强度为凋亡强度。用DAPI来标记细胞核。TUNEL与细胞核的共定位显示出它们的位置关系。
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<小鼠肾组织的TUNEL染色>[4]
5. TREM2−/−视网膜的TUNEL染色
为了检验TPM1敲低引起的炎症增加是否导致LPS处理的TREM2−/−小鼠更多的细胞凋亡，进行了TUNEL染色。对PBS、脂多糖（LPS）和siTPM1-1或siCTR处理后TREM2−/−小鼠的TUNEL染色和TUNEL阳性细胞的定量，根据荧光信号的强弱，可以观察到与PBS处理的TREM2−/−对照视网膜相比，LPS显著增加了siCTR-处理的TREM2−/−视网膜中TUNEL阳性细胞的数量（3.73倍）。
总结
TUNEL 染色是一种广泛使用的细胞凋亡检测技术。它基于细胞凋亡过程中DNA的断裂，产生大量带有3'-OH末端的DNA片段。这些3'-OH末端可以在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，被带有荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素的dUTP标记，从而实现对凋亡细胞的可视化。
相关参考文献
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