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知识点1 — 银屑病的发病机制
银屑病是一种常见的慢性免疫介导的皮肤病，其特征为皮肤上出现红色鳞屑斑块。银屑病的发病机制复杂，涉及免疫系统异常、遗传易感性、环境因素等多个方面。其核心发病机制是免疫系统的异常反应，尤其是T细胞介导的免疫反应。这些T细胞在免疫反应中释放多种细胞因子（如IL-17、IL-22和TNF-α等），从而促进角质形成细胞的增生与分化，导致皮肤表面形成厚重的鳞屑和炎症反应。此外，银屑病的发生还与多个细胞信号通路的异常激活有关，如NF-κB通路（参与免疫反应和炎症反应的调控）和JAK-STAT通路（细胞因子介导的信号通路），其中IL-22/IL-17与银屑病的发生密切相关。
知识点2 — 超氧化物歧化酶酶活性测定
超氧化物歧化酶（SOD）酶活性用总SOD活性检测试剂盒进行测定。其原理是黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下产生超氧化物阴离子，超氧化物阴离子可以与水溶性四唑盐（WST-1）反应产生黄色水溶性甲臜染料，在450 nm处有吸收。而SOD能够催化超氧化物阴离子发生歧化反应，降低超氧化物阴离子含量，即SOD的活性与甲臜染料的生成呈现负相关性。因此可通过测定WST-1产物的吸光度计算SOD的活力。
知识点3 — 转录组测序技术
转录组测序（mRNA-Seq）是使用高通量测序技术，在给定时刻从一个基因组中，揭示RNA的存在和数量的一个技术，可用于预测基因结构、可变剪切和其他转录修饰，并可定量测定每个转录本在生长过程中和不同条件下表达水平的变化。转录组测序技术流程主要包括样品制备、文库构建、DNA成簇扩增、高通量测序和数据分析，相对于传统的芯片杂交平台，转录组测序无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号、更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组的强大工具。
（a）不同倍率WRA-PEG的透射电镜结果。根据透射电子显微镜，可以看到WRA-PEG是均匀的圆形颗粒，粒径较小（50.18 nm）。粒径小的纳米粒子可以更有效地穿透细胞膜并进入细胞内部，从而实现纳米粒子的快速传输和分布。（b）WRA-PEG的红外光谱。从红外光谱可以看出，C-O-C醚键在1287 cm−1处的伸缩振动峰和C-O键在1098 cm−1处的伸缩振动峰表明PEG已成功修饰到颗粒上。几个关键峰（例如1421 cm−1处的羧酸盐对称伸缩振动、955 cm−1处的W = O伸缩振动和813 cm−1处的W-O-W伸缩振动）支持样品中存在W-RA配位化合物。因此，从样品WRA-PEG的红外光谱和制备过程的描述可以看出，红外光谱中的特征吸收峰与制备过程中的化合物一致，可见PEG修饰成功。（c）WRA-PEG的粒径分析。纳米粒子可以很好地分散在水、PBS和DMEM中。在水、PBS和DMEM中测得的DLS直径分别约为110 nm、90 nm和120 nm，并且在储存过程中没有明显的波动。良好的分散性与稳定性为其在生物医学、材料科学等领域的广泛应用奠定了坚实的基础。
（a）WRA-PEG的SOD酶样活性示意图。（b）WRA-PEG的SOD模拟活性。可以看出，WRA-PEG的SOD酶样活性具有剂量依赖性，总SOD（T-SOD）样活性随着浓度的增加而增加。其中，当WRA-PEG浓度为50 µg/mL时，T-SOD达到74.66% ± 1.67%。（c）WRA-PEG的总抗氧化活性。在测试WRA-PEG的抗氧化活性时，选择维生素C（VC）作为阳性对照，因为它稳定、高效、易得、抗氧化机制明确。首先，测试了WRA-PEG的总抗氧化活性，100 μg/mL的WRA-PEG的总抗氧化活性为0.42 ± 0.02 mM，低于100 μg/mL的VC（值为0.58 ± 0.09 mM）。然后，进一步测试了WRA-PEG对自由基的清除活性。（d）WRA-PEG的DPPH自由基清除活性。浓度为100 µg/mL时，WRA-PEG的DPPH清除活性测得为66.25% ± 3.68%，相当于相同浓度下VC清除活性的约68%（97.67% ± 1.35%）。（e）WRA-PEG的OH−自由基清除活性。相比之下，WRA-PEG在100 µg/mL时表现出43.64% ± 2.18%的OH−清除活性，与相同浓度下VC的活性（45.27% ± 3.27%）相当。（f）WRA-PEG的ABTS+自由基清除活性。同时，相同条件下，100 μg/mL的WRA-PEG的ABTS+自由基清除活性优于VC。因此，合成的WRA-PEG具有良好的抗氧化清除活性。这可能是由于合成原材料中存在RA。（g）WRA-PEG反应前的X射线光电子能谱（XPS）检测结果。（h）WRA-PEG与DPPH、OH−和ABTS+自由基反应后的XPS检测结果。结果表明，研究合成的WRA-PEG含有约20%的正四价钨（W4+）和11%的W5+，它们在抗氧化机制中发挥着至关重要的作用，其中W4+的贡献更为显著。通过测量W价态的变化，可以更好地阐明WRA-PEG的抗氧化机制。WRA-PEG系统良好的生物相容性和稳定性进一步强调了其作为对抗氧化应激的有效且有针对性的策略的前景。
（a）细胞实验设计及结果示意图。在本研究中，研究了WRA-PEG对五种细胞因子混合物（Mix）诱导的HaCaT细胞过度增殖的影响，旨在阐明ROS清除和减轻炎症之间的相互作用。（b）CCK-8检测WRA-PEG对银屑病样细胞模型细胞增殖的影响。结果显示暴露于Mix显着增强了HaCaT细胞的增殖。然而，用WRA-PEG处理48和72 h有效抑制了这种过度增殖。（c）WRA-PEG对银屑病样细胞模型中ROS的影响。众所周知，ROS会氧化非荧光2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH），产生荧光2',7'-二氯荧光素（DCF）。在这种情况下，观察到用Mix处理的HaCaT细胞中ROS水平显着升高，而WRA-PEG治疗显着降低，表明其对氧化损伤的保护作用，这对于减轻导致银屑病角质形成细胞活化和增殖恶性循环的炎症环境至关重要。（d）为了进一步阐明WRA-PEG对炎症水平的影响，首先通过RT-qPCR检测了关键炎症因子的表达水平，包括TNF-α、IL-6、IL-22和S100A8 mRNA。结果表明WRA-PEG可以显着降低这些炎症细胞因子的表达，通过ELISA进一步验证了TNF-α和IL-18的表达水平。因此，WRA-PEG通过清除ROS并减轻相关的炎症反应解决了银屑病的两个关键致病因素：它减少了氧化应激并减轻了由此产生的炎症级联反应。进一步推测WRA-PEG可以通过消除过量的ROS来打破氧化应激和持续性炎症之间的恶性循环，从而抑制角质形成细胞的异常增殖。因此，这些结果有力地支持了WRA-PEG在银屑病治疗中的价值，并强调了调节ROS水平和抑制炎症反应的双重治疗策略的必要性。
（a）IMQ诱导银屑病样小鼠模型、治疗及治疗方案。为了证实WRA-PEG对银屑病的治疗作用，采用IMQ乳膏建立银屑病样小鼠模型。然后外用WRA-PEG等药物观察小鼠银屑病样表型变化和表皮厚度。结果表明：IMQ诱导模型小鼠背部、耳部皮肤红斑、鳞屑明显增多。WRA-PEG对银屑病样小鼠模型背部（b）和耳朵（c）的治疗作用。外用WRA-PEG处理小鼠，红斑减轻，鳞屑减少，皮肤病变厚度减少。H&E染色结果显示，WRA-PEG能降低小鼠表皮厚度，改善银屑病样表型。选择Benvimod作为阳性对照，结果显示WRA-PEG组比Benvimod组更有效地缓解IMQ诱导的银屑病样表型。（d）IMQ组促炎细胞因子IL-17、IL-22、TNF-α的mRNA水平显著升高，WRA-PEG处理后显著降低。效果优于Benvimod组。（e）体内ROS水平评估显示，WRA-PEG处理显著改善了IMQ诱导的氧化应激。WRA-PEG可以通过其抗氧化作用有效清除这些ROS，保护皮肤细胞免受其侵害，从而进一步缓解疾病的进展。
（a）IMQ诱导的银屑病样复发模型方案。按照标准造模过程，IMQ诱导银屑病样小鼠模型，给予相应药物治疗1周，然后给予银屑病样小鼠模型1个月的恢复期，在恢复期1个月，IMQ治疗小鼠的银屑病样表型逐渐恢复。恢复1个月后，再次用IMQ刺激小鼠，诱导银屑病复发模型，再用WRA-PEG和Benvimod等药物治疗。（b）结果显示，复发组小鼠出现明显的红斑鳞状斑块，表皮厚度增加。用WRA-PEG处理的小鼠皮肤出现轻微的银屑病样病变和耳部厚度。H&E染色结果显示，与复发组比较，Benvimod组和WRA-PEG组耳部厚度减小。WRA-PEG的治疗效果优于阳性药物本维莫德。（c）WRA-PEG对银屑病样小鼠复发模型中ROS的影响。体内ROS检测显示，WRA-PEG处理可显著预防小鼠氧化应激损伤。这些数据表明WRA-PEG治疗是预防银屑病样皮肤损伤疾病复发的有效治疗方法。WRA-PEG治疗效果优于传统的本维莫德治疗。（d）WRA-PEG对银屑病样小鼠复发模型中细胞因子表达的影响。WRA-PEG和Benvimod治疗后，均抑制了炎症因子IL-17和TNF-α。
（a）WRA-PEG治疗银屑病的安全性试验方案。对WRA-PEG的安全性进行了评估，包括观察肝脏、肾脏和其他重要器官的功能和结构。（b、c）WRA-PEG对银屑病样小鼠肝功能的影响。WRA-PEG治疗后银屑病样小鼠模型肝组织组织学评价（H&E染色）。通过检测谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST），结果表明WRA-PEG组与其他组无显著性差异；H&E染色结果也显示，WRA-PEG组小鼠肝结构未见明显变化。这说明它不会影响小鼠的肝功能。（d、e）WRA-PEG对银屑病样小鼠肾功能的影响。血尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）表征肾功能。WRA-PEG治疗后银屑病样小鼠模型肾组织组织学评价（H&E染色）。BUN与Cr的检测结果表明，WRA-PEG组与其他组无显著性差异；H&E染色结果也显示，WRA-PEG组小鼠肾结构未见明显变化。（f）WRA-PEG对银屑病样小鼠血脂水平的影响。甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）表征血脂水平。（g）WRA-PEG对银屑病样小鼠脏器指数（脏体比，是实验动物某脏器的重量与其体重的比值）的影响。实验结束后，称重处死小鼠，肉眼观察小鼠的脏器（心、肝、脾、肺、肾等）和胸腔、腹腔。IMQ小鼠脾脏肿胀，可能是银屑病样症状引起的，而WRA-PEG治疗的银屑病小鼠肿胀不明显，可能是WRA-PEG缓解了银屑病样症状。脏器指数与病理试验结果相互印证。从结果可以看出，各组之间没有明显差异，可以初步证明WRA-PEG不会引起小鼠内脏的病理改变。除肝、肾外，还对各组小鼠的心脏、脾脏和肺进行H&E染色。结果显示：IMQ小鼠脾脏淋巴滤泡增大，细胞浸润明显，可能伴有淋巴细胞聚集。提示银屑病模型脾脏免疫反应增强，可能与全身炎症反应有关。经Benvimod和WRA-PEG处理后，小鼠脾脏得到改善，淋巴滤泡形态和分布趋于正常。炎症细胞浸润减少，说明本维莫德和WRA-PEG处理对脾脏的炎症反应有特异性抑制作用，可能有助于恢复脾脏的正常功能。尽管如此，心脏和肺之间的H&E结果没有明显差异。上述结果表明，WRA-PEG无脏器毒性，并能缓解银屑病样小鼠模型脾脏的高炎症状态。
（a）火山图显示WRA-PEG处理后的表达差异。通过将WRA-PEG组与对照组（Con组）进行比较，发现895个差异基因，其中578个基因上调，317个基因下调。（b）显示WRA-PEG处理后基因差异表达的热图。基于差异基因表达谱的无监督聚类分析表明，样本根据各自的组进行分类，突出了WRA-PEG组和Con组之间转录组特征的显著差异。（c）WRA-PEG处理后显著富集的生物过程（BP）。为了更深入地了解WRA-PEG治疗银屑病的机制，进行了详细的基因本体（GO）富集分析。该分析显示，许多与细胞粘附和免疫反应相关的基因显著富集，表明WRA-PEG可能通过调节细胞相互作用和炎症反应发挥保护作用。此外，与小分子代谢和细胞信号转导相关的基因也表现出高表达水平，这可能与抗氧化应激机制有关。这些发现支持WRA-PEG在减轻银屑病相关炎症和氧化损伤方面的潜在功效。（d）WRA-PEG处理后显著富集的关键KEGG信号通路。此外，KEGG通路富集图显示多种炎症相关信号通路显著富集，包括JAK-STAT、TNF和IL-17。这进一步证实了WRA-PEG治疗银屑病的抗炎作用，与前期的研究结果一致，表明WRA-PEG可以有效降低炎症因子表达，抑制表皮细胞增殖。（e）WRA-PEG治疗银屑病过程中与氧化应激和炎症相关的关键基因。此外，通过将从基因富集分析（GSEA）获得的氧化应激和炎症相关基因与转录组分析中鉴定出的差异表达基因交叉，鉴定出9个关键基因。（f）氧化应激和炎症相关关键基因的蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络。基于STRING数据库构建这9个关键基因的PPI网络。根据度值对每个节点进行排序，并采用Min-Max标准化来评估每个基因的潜在治疗效用。发现的前两个关键基因是巨噬细胞炎症蛋白3α（CCL20）和TNF超家族成员10（TNFSF10），它们在网络中表现出很强的相互作用。这表明它们可能在WRA-PEG治疗银屑病的抗炎和抗氧化机制中发挥核心作用。未来的研究将集中于阐明这两个基因在银屑病治疗中的具体作用，并确定其潜在的治疗靶点。
本研究成功制备了一种新型的钨迷迭香酸纳米酶（WRA-PEG）。通过PEG表面进行精细修饰，WRA-PEG具有粒径小、稳定性高、毒副作用可能性低的特点，为临床应用提供了安全保障。合成的WRA-PEG具有良好的抗氧化活性，其中对OH-自由基的清除能力可达到与阳性对照VC相当的水平，对ABTS+自由基的清除能力甚至优于VC。与目前临床一线药物本维莫德相比，WRA-PEG在改善银屑病样表型和预防复发方面具有显著优势。其高效的SOD催化活性可以清除ROS，显著抑制IMQ诱导的银屑病样小鼠模型的表皮厚度、角质细胞增殖和促炎细胞因子水平，有效减轻氧化应激对皮肤的损伤，从而显著缓解银屑病症状。此外，WRA-PEG治疗前后细胞的RNA测序结果显示，WRA-PEG可能与抗炎或促修复作用、免疫调节、氧化应激等途径有关。本研究为开发更多具有相似特性的纳米药物提供了宝贵的实验和理论基础，为未来医学领域的发展注入了新的活力。
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